16s-rRNAseq

何为16s rRNA测序

• 16s rRNA是细菌核糖体RNA上的一个亚基，16S rDNA就是编码该亚基的基因（16S rDNA=16S rRNA基因）。细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S、23S rRNA。16S rDNA只存在于所有细菌染色体基因中，真菌没有，病毒没有，高等动物更没有。

• 16S rDNA全长约1500bp，由V1-V9九个可变区和若干保守区组成。我们扩增的是其中的V3-V4区。尽管这段区域在不同物种间差异度更高，但不能保证将所有的细菌种类完全鉴定区分，这也是扩增子测序对鉴定出的微生物有分类水平限制的重要原因之一。

16S测序的分析流程

https://mp.weixin.qq.com/s/EAJpBOUjNrlHAjbpPW394w

https://github.com/taowenmicro/EasyMicrobiomeR

分析步骤

• ASV 分析

DADA2方法主要用于降噪，它不再以相似度聚类，只进行去重(dereplication)或者说相当于以100%相似度聚类。使用DADA2降噪后产生的每个去重的序列称为ASVs (Amplicon Sequence Variants)，或称为特征序列(对应于OTU代表序列)，而这些序列在样本中的丰度表称为特征表(对应于OTU表)。DADA2方法比传统的OTU方法更加敏感和特异，能够检测到OTU方法遗漏的真实生物变异，同时输出的假序列更少。同时，ASVs替代OTU提高了标记基因数据分析的准确性、全面性和可重复性。

采用QIIME2的classify-sklearn算法对每个ASV使用预先训练好的Naive Bayes分类器进行物种注释。

根据ASVs注释结果和各样品特征表，获得界、门、纲、目、科、属、种水平物种丰度表，这些带有注释信息的丰度表格是扩增子分析的核心内容。根据不同的实验目的，可以从各个分类水平的物种丰度表中（通常关注门和属水平）筛选一个或几个重点关注的物种，结合不同样品（组）物种组成及差异分析，聚类分析等结果进行深入研究。

ASV/OTU表格