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description: By Yiyuan & Kaiyi
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# Cas9-RNP/mRNA电转染

## mRNA电转实验步骤（T细胞）

* 1、复苏T细胞4h以上，将T细胞培养体系转移至50mL离心管【过滤以除去死细胞】，用opti-MEM补足50mL【此步用来洗清血清，避免影响电转效率】；
* 2、离心之前计数：台盼蓝：T细胞=1:1（10ul）；
* 3、500G 离心5min，弃去上清，弹匀；离心期间在6或12孔板（每孔最多5ml）加X-VIVO培养基，放入培养箱37℃预热。同时取出-80℃冻存的mRNA（1000ng/μL，每支10μL，可以电10\*10^6细胞），待其融化至室温；
* 4、加1mL opti-MEM，转移至1.5ml EP管，4000rpm 2min离心，弃去上清，弹匀；
* 5、按上述步骤重复清洗一次；随后用800ul 1×opti-MEM重悬细胞。（认为耗损率为80%）
* 6、取一包RNAase free黄枪头，吹匀细胞悬液，再加入mRNA溶液混匀，在电转杯中加入100μL上述细胞液并吹匀【注意避免气泡】
* 7、盖上电转杯杯盖，500V 700μs电转，随后立即将其转移至12孔板中【倾斜电转杯以便吸液】，继续培养【注意用封口带封口，轻晃一下板子，37℃】，8-12h培养后测表达。

{% hint style="info" %}
细胞量：min 10million（10×106），mRNA量：10ug（使用分装好的mRNA，1ug/ul per tube 20ul）。

电转条件：电转杯为0.2cm

（1）刺激过的T细胞（细胞变大，通透性高）：500V 700μs

（2）未刺激T细胞（antiCD3\&CD28）：500V 800μs
{% endhint %}

## Cas9-RNP电转原理

* **RNP指的是“核糖核酸-蛋白质复合物”，它由RNA和蛋白质组成。**&#x5728;RNP体外切割技术中，我们主要关注的是RNA引导的核酸内切酶（RGN）和CRISPR/Cas9系统中的Cas9蛋白。这两种物质协同作用，能够精确地对目标DNA进行切割。
* **原理：**&#x9996;先，设计一段与目标DNA序列互补的RNA（称为gRNA），将其与Cas9蛋白结合形成RNP。当RNP与目标DNA结合后，Cas9蛋白会在gRNA的引导下，对目标DNA进行精确切割。这样一来，我们就可以实现对特定基因的编辑、插入或删除等操作。

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FAnA0UV68dW6xeMWRBBYo%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=c084360d-55e0-4ed8-b32e-351e5a443246" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

* 电转使用仪器为Neon NxT 转染仪，操作演示视频如下：

{% embed url="https://www.youtube.com/watch?v=mXGtR04nu8o" %}
演示视频
{% endembed %}

## Cas9-RNP复合物电转

### 1、提前配置试剂：

* Cas9蛋白分装与储存：苏州泓迅生物提供，浓度为10mg/mL，按10μL分装后，保存于-80℃，避免反复冻融。
* EasyEdit sgRNA 溶解与储存：将粉末状 EasyEdit sgRNA （苏州泓迅生物，RNA的3 'and 5'经过2'-0Me 与Phosphorothioate修饰, HPLC Purification）用无核酸酶 TE buffer 溶解至 <mark style="color:red;">100 pmol/μL</mark> ，也即<mark style="color:red;">100μM</mark> (2nmol + 20μL TE buffer溶解)，或其他需要的浓度，按需分装，保存至-20℃，避免反复冻融，如需长期存储，保存至-80℃。

> RNA化学合成：需要将设计的sgRNA序列的T改成U，在sgRNA的5’和3’端各加3个硫代和甲氧基修饰，可以提高sgRNA稳定性，并降低脱靶效应，并添加scaffold序列

* 配置电转后的培养基，<mark style="color:red;">37度预热</mark>：
  * 对于knock-out，配置含有10%FBS但<mark style="color:red;">不含双抗</mark>的培养基；
  * 对于knock-in，可以向上述配置好的培养基中加入<mark style="color:red;">NHEJ抑制剂或HDR增强剂</mark>（例如1：10000加入10mM的 SCR7 DMSO贮存液，使SCR7终浓度为1μM）；

### 2、细胞铺板与预处理：

* 将细胞提前铺板，直至长满T25；
* 对于knock-in，实验前12-16h，可向培养物中添加细胞周期阻滞剂<mark style="color:red;">诺考达唑（Nocodazole）</mark>，最终浓度为<mark style="color:red;">0.3 μmol/L</mark>（1：30稀释10μM的储存液，如8mL培养基添加240μL）。置于37℃，5% CO<sub>2</sub>条件下培养12-16 h。

### 3、消化细胞：

* 正确组装好Neon NxT 电转仪电路，直至右侧出现黑色圆圈；
* 取状态良好的对数期生长的靶细胞（约一个T25），弃培养基，用<mark style="color:red;">不含钙镁的DPBS</mark>冲洗一遍，加入1mL胰酶消化，400g离心5min（悬浮细胞可直接收集）；
* 弃去细胞沉淀上清，用1mL <mark style="color:red;">不含钙镁的DPBS</mark>重悬，计数；
* 对于knock-out：从细胞悬液中吸取<mark style="color:red;">1.5×10^6左右</mark>个细胞于无菌的1.5 mL EP管中，400g离心5min，弃上清，用 <mark style="color:red;">65 μL</mark> <mark style="color:red;">GE buffer</mark> 重悬细胞；
* 对于knock-in：由于HDR模板的存在，可以适当增加细胞浓度，取<mark style="color:red;">2\*10^6</mark>左右个细胞于无菌的1.5 mL EP管中，400g离心5min，弃上清，用 <mark style="color:red;">65 μL</mark> <mark style="color:red;">GE buffer</mark> 重悬细胞；

### 4、制备CRISPR-Cas9 RNP复合物

* 细胞离心期间，准备若干EP管并标记，每条sgRNA（包括对照的sgSCR）需要1个EP管；
* 对于knock-out，在每个1.5 mL EP 管中分别加入：
  * <mark style="color:red;">65 μL</mark> Neon NxT Resuspension <mark style="color:red;">GE buffer</mark>（Thermo）
  * 100 pmol Cas9 蛋白（<mark style="color:red;">1.63μL</mark>\*10mg/mL）
  * 200 pmol EasyEdit sgRNA（<mark style="color:red;">2μL</mark>\* 100 pmol/μL）
  * 室温下<mark style="color:red;">孵育 10 min</mark>（37℃ 5分钟）；
* 对于knock-in：
  * 先配置上述65μL体系，室温孵育10min（37℃ 5分钟）；
  * 可选：ssDNA与RNP混合前5分钟，65℃水浴5分钟破坏二级结构，立即冰浴2分钟防止复性；
  * 再从上述体系中分别吸取<mark style="color:red;">6.5μL</mark>另外2个新的EP管，其中一管在Cas9-RNP基础上再加入≤<mark style="color:red;">1μg（如0.3ug-1μg）HDR模板</mark>（ssDNA或dsDNA，浓度最好至1μg/μL）；
  * 室温继续孵育10min（或混合HDR模板后置于冰上）；

> Cas9-RNP的配比：
>
> * Cas9与sgRNA比例约为1比2，如100pmol Cas9+200pmol sgRNA+100pmol ssDNA；
> * 推荐的Cas9蛋白浓度：100pmol Cas9蛋白溶于130μL（65μLRNP+65μL细胞）体系，浓度约为120ug/1mL（0.769 nmol/L），即为推荐浓度；
> * 推荐的sgRNA浓度：为Cas9浓度两倍，约1.54 nmol/L；
> * 推荐的细胞浓度：推荐每10μL电转体系约包含1\*10^5个细胞（细胞浓度推荐在2\*10^6-1\*10^7个/mL之间），130μL体系需要<mark style="color:red;">1.3\*10^6</mark>个细胞；
> * 推荐的HDR DNA模板浓度：33-100 nmol/L，即每13μL电转体系需要<mark style="color:red;">0.3-1μg</mark>的DNA；
>   * 计算：对于2300bp的ssDNA，1 µg对应于约1.43pmol，13μL体系要达到33 nmol/L，需要0.43pmol≈0.3μg；
>   * 计算：有文献推荐dsDNA浓度要达到0.5μM in 10μL，即5pmol每管，可按照DNA分子量进行换算；
>   * DNA大小及质量换算：[https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/references/ambion-tech-support/rna-tools-and-calculators/dna-and-rna-molecular-weights-and-conversions.html](https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/references/ambion-tech-support/rna-tools-and-calculators/dna-and-rna-molecular-weights-and-conversions.html)

### 5、混合细胞与Cas9-RNP复合物

* 对于knock-out：将65μL细胞悬液与65μL Cas9 RNP复合物悬液混匀，<mark style="color:red;">室温下孵育10min</mark>；
* 对于knock-in：向Cas9-RNP-DNA混合物中，加入6.5μL细胞悬液，室温孵育10min；
* 等待期间，向12/24孔板中加入不含双抗的培养基，对于knock-in，可以添加含有<mark style="color:red;">终浓度1μM的SCR7</mark>的不含双抗的培养基；

### 6、电转染

* 将<mark style="color:red;">2 mL</mark> <mark style="color:red;">E10 buffer</mark>（适用于10μL电转体系；E100 buffer则适用于100μL体系）加入到透明的buffer tube，并插入到底座上；
* 用电转枪吸上10 μL电转枪头，按下白色plugger，确保金属吸头可以回弹；
* 电转枪小心缓慢吹匀并吸取细胞与Cas9 RNP混合物（<mark style="color:red;">避免气泡！！！</mark>），将带有细胞悬液的电转枪插入电击杯中，如安装对位将亮蓝灯；
* 设置包括电压（V）、时间（s）、脉冲次数在内的电转参数，选择正确的<mark style="color:red;">Buffer种类</mark>（GE buffer），对上述混合物进行电转（可以同时在同样参数下电转EGFP对照组），电转成功后亮绿灯；
  * 对于KO，HCT116细胞推荐1600/10/3，1700/20/1，1400/20/2
  * 对于KI，HCT116细胞推荐1400/20/2，1600/10/3，930/30/2
  * MC38细胞在1200V-1700V电转效率均可
  * 如电转效果不佳，可以尝试增加电压如2300/3/4，2500/2/5，但会增加细胞死亡率
* 从底座中拔出电转枪，将电转后的各组细胞分别转移至12或24孔板中（<mark style="color:red;">培养基加血清但不加抗生素</mark>），先按蓝色ejector再按白色plugger，弃去电转枪吸头；
* 轻轻吹匀细胞，将细胞放置培养箱中培养；
* 对于KI的细胞，30分钟后向培养基中添加<mark style="color:red;">1-2.5μM的Nedisertib</mark>（贮存液为10mM in DMSO，用培养基1：10000-1：4000稀释）
* 电转后前1-2天可以添加<mark style="color:red;">10 μM ROCK inhibitor Y27632</mark>抗凋亡；
  * 注：一般电转 1 h 后，细胞一般可以恢复活性，膜修复会完成。但因为质粒有毒性，膜修复完成后细胞也可能会因为毒性而死去；
* 24h后观察细胞状态，换液，如有条件可根据EGFP对照情况判断电转效率；
* WB/qPCR检测敲除效率，进而分选单克隆。

HCT116 knock-in 电转参考文献：

{% embed url="https://www.nature.com/articles/s41596-024-01043-6" %}

{% embed url="https://link.springer.com/article/10.1186/s12864-023-09377-3#Sec10" %}

{% file src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FlVcI7wa4jqf63AQvC8sm%2FCAS9%E6%A0%B8%E9%85%B8%E9%85%B6.pdf?alt=media&token=8a15ccf6-83a4-45cd-989d-016978e43c1c" %}

{% file src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FwYTcGq4OLv3X5noKYDCE%2FEasyEdit%20sgRNA%20%E4%BD%BF%E7%94%A8%E8%AF%B4%E6%98%8E%E4%B9%A6.pdf?alt=media&token=f698a2f4-0a81-48f4-990a-e519a454441a" %}
