# CRISPR-KO（慢病毒） ## CRISPR基因编辑基本原理 CRISPR/Cas9是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA指导Cas9蛋白对靶向基因进行修饰的技术，该系统灵活简单、可以对特定基因组位点进行切割置换的，特异性高、细胞毒性低。

CRISPR/Cas9系统是利用Cas9核酸酶在向导RNA的指引下通过识别基因组的任何位点保守的间隔相邻基序（PAM，序列为NGG），在PAM的上游对DNA进行定点切割。使用CRISPR/Cas9系统可以很简便地为内源性基因标记标签。除此之外，CRISPR/Cas9系统也可以用于其他的基因组工程，如基因抑制（突变，缺失，插入），用于启动子研究的荧光素酶报告基因置换或绿色荧光蛋白基因置换，基因敲入以及用于治疗的基因修复等。

## CRISPR-KO实验步骤 ### 一、 sgRNA靶序列的确定 * sgRNA的设计原则： * 选择PAM位点（NGG）的前20个核苷酸序列作为Cas9核酸酶识别靶点 * 如果想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上 * 通常基因会转录成多个isoforms，所以选择尽量靠近5’端的公共部分（consensus CDS），保证每个isoform都会成功移码突变 * 应避免以4个以上的T结尾（poly T是真核生物终止转录的信号）以免提前终止转录； * 尽量避开GC富集区域，GC%含量最佳为40%-60%，以防止甲基化对互补配对的干扰 * 如果构建U6启动子或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率 * 全基因的脱靶效应分析，需要考虑脱靶位点的错配碱基数，最多不超过5个 * 设计网站： * 从赛默飞网站找：TrueGuide Synthetic gRNA | Thermo Fisher Scientific - CN输入基因ID/Gene Symbol和物种（Human/mouse）搜索以后，点击Details就能看到target序列的信息 * 赛默飞设计网站： * * * * * 脱靶分析网站： * * Non-targeting 20 nt scramble guide RNA (Control sgRNA)： * GTATTACTGATATTGGTGGG ### 二、质粒酶切位点+靶序列引物的设计常见的慢病毒载体如LentiCRISPRv2（），同时带有sgRNA和Cas9序列，以及puro抗性。该载体用BsmBI酶可以切下来一个2000bp左右的filler片段，U6可以用来测序。或者采用下方类似的pHKO23质粒，同样带Cas9，只是酶切下来的序列更短（20bp）。 {% file src="" %} 带有更短filler的LentiCRISPRv2质粒图谱 {% endfile %} 也可以用衍生的其他载体，如Bsd抗性的不带Cas9的Lenti-sgRNA blast载体（），可以和puro抗性的Cas9/iCas9（inducible Cas9）质粒搭配使用（）。Lenti-sgRNA blast载体同样采用BsmBI酶切开，可以产生1900bp左右片段。 {% file src="" %} * **BsmBI的酶切位点：**识别非回文序列，在识别序列外进行切割，酶切后是粘性末端；在酶切V2质粒后产生两个不一样的粘性末端，所以不会自连。

* 酶切之前的序列

* 酶切后的粘性末端

* 值得注意的是，BsmBI只在CRISPR V2空载质粒上有两个酶切位点，在已经构建好的sg质粒中无酶切位点（CRISP2 V2经酶切后，由于一部分酶切位点在1850左右bp的片段里，已经丢失），因此构建sgRNA只能用CRISPR V2空载质粒构建，而不能用已经构建好的sg质粒再来构建别的sg质粒。 * 酶切连接后sgRNA target序列正好在U6启动子下游，sgRNA target序列下游就是gRNA scaffold序列，与sgRNA一起转录出来发挥gRNA的引导功能。

* 正向引物：在20个碱基（不包含NGG）前加CACCG序列（形成粘性末端），最后是25碱基 * 反向引物：在20个碱基前加AAAC，最后面加C（使互补配对更稳定），最后是25碱基 * 注意序列正反顺序（订引物时从5‘-3’）！ * 如果载体不脱磷，oligo不需要磷酸化 ### 三、载体酶切在LentiCRISPRv2载体中有两个BsmBI酶切位点，两个位点之间的片段为1885bp，酶切连接后sgRNA正好在U6启动子下游，连接后的sgRNA下游就是gRNA scaffold序列；BsmBI酶切之后不需要CIP脱磷也不会自连 * 在冰上配置以下酶切体系（酶最后加） | LentiCRISPRv2 plasmid | 2μg | | ------------------------- | ---------- | | BsmBI-v2（BioLabs, R0739S） | 1μL | | 10X NEB buffer r3.1 | 3μL | | H2O | up to 30μL | | total | 30 uL | * 加入以上成分，于55摄氏度酶切4小时（说明书是15分钟，但是容易切不完全）； * 热灭活 80℃ 20分钟（可以不做）； ### 四、琼脂糖电泳+胶回收纯化 #### 【配置电泳液与1%琼脂糖凝胶】 * 配置1X TAE：量筒量取980mL去离子水，20mL50x TAE，混匀溶解（TAE主要成分包含Tris/冰醋酸/EDTA）。重复配置一次，得到2L的1X TAE溶液（下一步电泳时也要用）。 * 配置琼脂糖溶液：天平称量0.5g琼脂糖，倒入锥形瓶，加入50mL 1X TAE溶液【小块胶】，锥形瓶盖上盖子，微波炉高火加热1.5-2min； * 趁热加入10000× GelRed核酸染料【也可以在DNA体系中添加sybr green作为替代】，摇晃均匀。

#### 【琼脂糖电泳】 * 提前清洗胶板、齿梳；组装胶板与齿梳； * 在确认胶板水平的情况下倒入琼脂糖溶液，按压，排出气泡； * 静候冷却15min以上，凝胶成形。拔出齿梳； * 打开电泳槽盖子，在电泳槽中加入足量1X TAE（液面可没过凝胶），放入凝胶【注意摆放的方向，有孔的一端朝左侧黑色负极，电泳槽上也有箭头】。 * 先在凝胶孔洞每排首尾各加2.5微升DNA Ladder（DL10000+的Ladder）; * 酶切的CRISPR质粒体系加入Gel Loading Dye, Purple (6X)，混匀，加到胶的孔里； * 加样时需要添加没有酶切的环状质粒+Gel Loading Dye作为对照； * 每个样本孔之间空一格，方便切胶回收。 {% hint style="info" %} 补充：正常超螺旋结构最紧凑，跑最快；直链线性质粒由于双链都断开变成松弛的线性DNA，不如超螺旋紧密，跑得相对慢；开环质粒，DNA双链的其中一条链断开，导致超螺旋能量被释放而使质粒变成松弛的环状结构，结构臃肿，跑得最慢。 {% endhint %} * 盖上盖子，接通电源（红对红，黑对黑），120V电压电泳20分钟； * 显影观察（注意排气泡）。

#### 【胶回收】（采用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)试剂盒或其他品牌试剂盒，具体详见说明书）注意：当天现配琼脂糖凝胶和TAE电泳液（不能用重复回收的）；提前准备1.5mL 离心管，写完标签，放一个黄色枪头； * 配置1.5%琼脂糖凝胶，趁热加入10000X的GelRed，倒入凝胶槽室温冷却 15 min。 * 将PCR或酶切产物与10x Loading Buffer混合（50μL每孔，45：5混合），首尾加DL10000/DL2000的DNA Marker 5μL，上样到琼脂糖凝胶上进行电泳（可以适量延长电泳时间，如30min，使条带尽可能分离）。 * 金属浴提前加热至50℃； * 从琼脂糖凝胶上切下单一的目的DNA条带，放入干净的1.5 mL离心管中，进行称重。 * 加入3倍体积的Buffer QG到1体积的凝胶中。(100 mg大约等于100uL) * 将离心管放入 50℃金属浴中，直到凝胶完全解。(此时溶液的颜色应变为黄色) * 向离心管加入一个凝胶体积的异丙醇，上下翻转离心管，使液体混匀。 * 为了结合DNA，将上述样品加到柱子中，12000 rpm 离心1min。【如果离心管内液体体积较多，可以在同一个柱子中多次重复加样，离心回收DNA，以提高单管的DNA浓度】 * 弃废液，向柱子中加入 500 μL Buffer QG，12000rpm 离心1min。 * 为了洗柱子，弃废液，再向柱子加入 750 L Buffer PE，12000 pm 离心 1 min。 * 弃废液，12000rpm 空离 1min。 * 将收集管换成1.5 mL离心管（用剪刀减去耳朵），加入30-50 uL Buffer EB 或水洗脱DNA(注意EB 加到滤膜上)，室温静置 1min 后，12000rpm 离心1min。 * 使用Nano Drop 系统测量回收产物浓度，注意使用相应的溶液做 Blank。 * 如10ug的 CRISPR V2质粒酶切完回收可以得到60ng/ul浓度的30ul左右产物。 ### 五、Oligo退火形成duplex * 退火方法一：用烧杯量取100-150mL自来水，微波炉高热煮沸后倒入烧杯/塑料盒，将配置好的引物对置入水浴，待其自然降温（约30-40分钟）； * 退火方法二：PCR仪反应条件：37℃ 30min → 95℃ 5min，然后按照5℃/min降温到25℃； * Duplex配置体系： | oligo1 | 1uL（100uM，用干粉直接配） | | ------ | ------------------------------------------------- | | oligo2 | 1uL（100uM，用干粉直接配） | | ddH2O | 8uL | | total | 10uL | * **用ddH2O，1：200稀释退火后的产物** ### 六、T4酶连接 * 在冰上按以下比例配置载体连接体系（酶最后加），混匀，室温连接4-6h（通常PCR仪设置25℃，连接1-2h），或16℃过夜；

Component	5微升体系用量	20微升体系用量
T4 DNA ligase (BioLabs, M0202L)	0.25 μL	1 μL
T4 DNA ligase reaction buffer (10X)	0.5 μL	2 μL
digested LentiCRISPRv2 plasmid	4 μL（32ng）	50ng（0.02pmol）
稀释后的Duplex	1 μL (0.015pmol)	37.5ng (0.06pmol)
Nuclease-free water	to 5 μL	to 20 μL
total	5 μL	20 μL

* 65℃热灭活10min，开始转化。 ### 七、转化 * 将金属浴预热至42℃，用烘箱37℃预热LB固体平板（加抗生素）和LB液体培养基（不加抗生素） * 从-80冰箱取一管DH5α感受态细胞（100μL），在冰上解冻 * 向上述步骤得到的5 μL重组质粒内加入5倍体积以上的感受态细胞（30-50μL）冰上放置30min（不要吹打） * 感受态细胞42℃热激1min * 冰上孵育2min * 向管内加入600μL预热的LB液体培养基（不含抗生素），吹打混匀 * 将管子置于孔板上，37℃，225rpm摇菌1h * 5000rpm离心1min，弃去上清，用100μL-200μL培养基重悬 * 在LB固体平板内加入重悬的菌液，用涂布棒涂布，室温放置2min，使其充分吸收 * 待菌液吸收，倒置平板，37℃培养16h ### 八、挑单克隆、测序 * 生物安全柜内、酒精灯旁，准备若干离心管，每管加一定量培养基配制所需要的选择性培养基（如5mL培养基加5μL的1000X氨苄青霉素）； * 酒精灯旁，用加样枪挑菌落，则选择100μL黄枪头，挑完直接把抢头打进管子里。 * 37℃温箱内固定在摇床上，盖子不能盖紧，220rpm振摇过夜【16个小时】，菌液送测序。平板和多余的菌液可放置于4℃保存。 ### 九、质粒扩增 * 如质粒序列无误，则可进一步扩增、提质粒。 * 生物安全柜内、酒精灯旁提前配制LB液体培养基，准备若干15mL的离心管，添加5mL（小提）或15mL（中提）的LB液体培养基，以及1000X的氨苄青霉素； * 酒精灯旁，向选择性LB培养基内添加4℃冰箱保存的测序后的菌液或者-80℃保存的甘油菌，加完直接把抢头打进管子里。 * 37℃温箱内固定在摇床上，盖子不能盖紧，220rpm振摇过夜（12-16个小时）。 * 第二天培养基变得混浊，说明细菌生长良好。 ### 十、质粒提取 * 参考试剂盒说明书进行。 ### 十一、病毒包装浓缩 #### 详见细胞转染、慢病毒包装与浓缩章节。 ### 十二、病毒感染 * -80℃拿出来的病毒在37℃迅速解冻，跟解冻细胞一样； * 如带有荧光，可进行感染预实验（详见慢病毒使用手册） * 病毒感染： * 悬浮细胞：需要加Ploybrene再Spinfection：细胞浓度在1-4\*10^6，向病毒液中加入1000X的Ploybrene（10mg/mL，每1mL体系加1μL），整个孔板室温1000g离心90min，使病毒和细胞充分接触； * 贴壁细胞：直接向病毒液中加1000X的Polybrene，使最终每1mL培养基体系对应1μLPolybrene，再向目的细胞加入病毒上清； * 病毒感染16-24h后换液，48h胰酶消化传代； ### 十三、嘌呤霉素筛选 #### **1、确定最佳嘌呤霉素浓度：** * 每个细胞系对嘌呤霉素的敏感性不同，在开始实验之前要确定细胞系的最佳嘌呤霉素浓度 * **Day1:** 准备六孔板或者24孔板，铺板目的细胞，第二天的细胞汇合度应在80%-90% * **Day2:** 加入嘌呤霉素，使每个孔的嘌呤霉素终浓度在1µg/ml到10µg/ml，具体梯度的设置数量可以去查查目的细胞相关的文献，也可以直接设置10个梯度，增量为1μg/mL * **Day3：**每天检查细胞，每隔一天更换为新鲜的含嘌呤霉素的培养基，选择在三到五天后导致细胞完全死亡的嘌呤霉素的最低浓度。 #### 2、添加最佳浓度的嘌呤霉素 * 转染48h后，铺板感染后的细胞和未感染的对照细胞，至第二天汇合度在70%-80%。 * 按之前得到的最佳浓度加入puromycin来筛选细胞，如1mL的培养基，加5μL的嘌呤酶素（1mg/mL），也就是说嘌呤霉素的终浓度是5μg/mL。 * 空细胞加puro组应当在三到四天内全部死亡，感染病毒组剩下的基本可以认为都是阳性细胞。 * 加了嘌呤霉素的培养基要每天更换，逐渐降低抗生素维持浓度（相较之前的药筛浓度，浓度减至之前浓度的 1/2\~1/4 或更低）继续对感染后的细胞进行筛选和扩增。 ### 十四、挑取单克隆 * 在分选单克隆前，可以先提DNA（处理组和对照细胞），在sgRNA位点前后设计引物进行PCR+sanger测序，结果可以用EditCo(ice.editco.bio)进行分析sgRNA 的indel 效率 * 详见CRISPR-KI相关部分。 ### 十五、单克隆鉴定 * PCR鉴定：在敲除片段的上中下处设计三对引物，提取WT细胞以及KO细胞的total DNA，进行PCR；PCR产物送Sanger测序，观察是否产生移码突变。 {% hint style="info" %} 注：因为gRNA设计的优劣差异，细胞转染感染程度高低，gRNA效价的高低都不同，所以在单克隆验证时可能存在敲除效果有些差异，尽量选取测序结果里缺失或者突变程度比较深的克隆，这样可以提高敲除效果；另外就是质粒筛选时，可以选用几条gRNA质粒或者慢病毒同时共转细胞，这样增加对同一条DNA编辑的概率，从而提高最终的敲除效果。 {% endhint %} * 两条sgRNA进行大片段敲除的鉴定：如下图，在2条gRNA位点前后分别设计引物，进行PCR，跑胶鉴定，挑选出纯合敲除的单克隆；如PCR两条产物长度非常接近，可以直接对混合 PCR 产物测序，否则分离两条条带，分别进行测序，或将PCR 产物 TA / TOPO 克隆后测序。

### 十六、细胞保种 * 在扩增的过程中持续冻存保种，保证每株细胞至少冻存 6 支。 * 冻存2-3后，取出一支复苏，判断细胞生长状态。