ELISA
By KY
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以乙酰辅酶 A(A-CoA)酶联免疫吸附测定为例。
用特异性抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的抗原会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的特异性抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素化的特异性抗体与结合在包被抗体上的抗原结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，抗原浓度与OD值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中抗原的浓度。
建议采用6孔板培养细胞，并保证细胞数量达到10^6左右，即细胞密度达70%-80%左右。
贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次，洗完最后一遍计数，取2*10^6个细胞。
每10^6个细胞中加入150-200 μL PBS重悬，推荐在PBS中加入 100× 蛋白酶抑制剂PMSF；由于要设置复孔，建议至少加300-400μL PBS。
通过反复冻融或超声使细胞破碎
反复冻融：-80℃放置1h/液氮放置0.5h，然后置于30℃水浴锅中，轻微振荡，使其迅速融化，此操作反复2-3次即可。
超声方法：冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次。
将提取液于4℃，1500×g离心10分钟，取上清检测。
稀释100倍：一步稀释。取5 μL样本到495 μL标准品/样本稀释液内，做100倍稀释；
稀释1000倍：两步稀释。取5 μL样本到95 μL标准品/样本稀释液内，做20倍稀释，再取5 μL 20倍稀释样本到245 μL标准品&样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释1000倍；
提前将培养箱或摇床温度设置为37℃。
提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温(18-25℃)。如果试剂盒需分多次使用，请仅取出本次实验所需的酶标板条和试剂，剩余板条拆卸后放入备用铝箔袋，试剂需按照指定条件保存。
洗涤液：将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:24)。按孔数计算所需量，洗板每孔需要1200μL洗涤液（每孔需要洗涤液350μL，重复洗8次）。
标准品工作液：
将标准品于10000×g离心1分钟，加入标准品/样品稀释液 1 mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，轻轻混匀，避免起泡，配成20 ng/mL的标准品工作液(或加入1 mL标准品/样品稀释液后，静置1-2分钟，用低速涡旋仪充分混匀。可通过低速离心去除涡旋过程中产生的气泡)。
然后根据需要进行倍比稀释。配制成以下浓度：20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0 ng/mL。
倍比稀释方法：取7支EP管，每管中加入500 μL标准品/样品稀释液，从20 ng/mL的标准品工作液中吸取500 μL到第一支EP管中混匀配成10 ng/mL的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。最后一管直接作为空白孔，不需要再从倒数第二管中吸取液体。 复溶后的20 ng/mL标准品工作液分装后放置-20℃保存，避免反复冻融。 倍比稀释的标准品工作液需要现配现用。
生物素化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100 μL/孔计算），实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟，将浓缩生物素化抗体于800×g离心1分钟，以生物素化抗体稀释液将100×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作浓度（例如：10 μL浓缩液+990 μL稀释液）。现配现用。
HRP酶结合物工作液：HRP酶结合物为HRP酶结合亲和素。实验前计算当次实验所需用量（以100 μL/孔计算），实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟，将浓缩HRP酶结合物于800×g离心1分钟，以 酶结合物稀释液将 100×浓缩HRP酶结合物稀释成 1× 工作浓度 （例如：10 μL浓缩液+990 μL稀释液）。现配现用。
分别设定 标准孔 、 空白孔 和 样本孔 。
标准孔加入 100 μL 倍比稀释的标准品；
空白孔加入 100 μL 标准品/样本稀释液；
其余孔加入 100 μL 待测样本，建议所有的待检样本和标准品在检测中设立复孔；建议通过预实验确定待检样本的稀释倍数 。
给酶标板覆膜， 37 ℃孵育 90 分钟。提 示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间宜控制在 10 分钟内。
在下一步骤开始前15分钟，将100X 生物素化抗体用生物素化抗体稀释液稀释成1×工作液（按每孔100μL计算）。
甩尽孔内液体，不用洗涤。用排枪在每个孔中悬空加入 生物素化抗体工作液 100 μL ，酶标板加上覆膜， 37℃ 温育 1 小时。
在下一步骤开始前15分钟，将100X HRP酶结合物抗体用酶结合物稀释液稀释成1×工作液（按每孔100μL计算）。
甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干残液。
每孔悬空加洗涤液 350 μL ，静置浸泡 1 分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，拍干。重复此洗板步骤 3 次。提示：此处与其他洗板步骤都可使用洗板机，参数设置：2点吸，每孔加入洗涤液350 μL，振板5秒，吸液0.5秒)。洗板完成后请立即进行下步操作，不要让微孔板干燥。
手动洗板：甩尽酶标板内的液体后，在吸水纸上拍干（3-5次），每拍一次更换吸水纸，直至孔中心残余液体不超过5μL，同时不应用力过大使得酶标板脱落。
每孔悬空加 HRP 酶结合物工作液 100 μL ，酶标板加上覆膜 37℃ 温育 30 分钟。
甩尽孔内液体，洗板 5次。方法同上。
每孔加TMB底物溶液90 μL ，酶标板加上覆膜 37℃ 避光孵育 15 分钟左右。提示：根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过 30 分钟。当标 准孔出现明显梯度时，前 4 个显色孔出现明显蓝色梯度 ，即可终止。 提前15分钟打开酶标仪预热。
每孔加终止液 50 μL ，终止反应。提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
立即用酶标仪在 450 nm 波长测量各孔的光密度 (OD 值）。
计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标， OD 值为纵坐标，在双对数坐标轴上拟合四参数逻辑函数的标准曲线。
若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
