# 酶联免疫吸附试验（ELISA）

以乙酰辅酶 A(A-CoA)酶联免疫吸附测定为例。

{% file src="<https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FKVtCxv0MeEvAktqn8SIL%2FElabscience%E4%B9%99%E9%85%B0%E8%BE%85%E9%85%B6%20A(A-CoA)%E9%85%B6%E8%81%94%E5%85%8D%E7%96%AB%E5%90%B8%E9%99%84%E6%B5%8B%E5%AE%9A%E8%AF%95%E5%89%82%E7%9B%92.pdf?alt=media&token=a8e3d5d5-bcf5-46c8-bd4c-e3b58fd53622>" %}

## 实验原理

用特异性抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的抗原会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的特异性抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素化的特异性抗体与结合在包被抗体上的抗原结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，抗原浓度与OD值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中抗原的浓度。

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2F6C9ggpXs22ivBNGKvcmd%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=503b9755-dd72-4a4c-add3-2afb24ecd6ad" alt="" width="375"><figcaption></figcaption></figure>

## 实验步骤

{% embed url="<https://www.elabscience.cn/resource-elisa_research-detail-428>" %}

### 1、细胞提取

* 建议采用6孔板培养细胞，并保证细胞数量达到10^6左右，即细胞密度达70%-80%左右。
* 贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次，洗完最后一遍计数，取<mark style="color:red;">2\*10^6</mark>个细胞。
* 每10^6个细胞中加入150-200 μL PBS重悬，推荐在PBS中加入 <mark style="color:red;">100× 蛋白酶抑制剂PMSF</mark>；由于要设置复孔，建议至少加300-400μL PBS。
* 通过反复冻融或<mark style="color:red;">超声</mark>使细胞破碎
  * **反复冻融：**-80℃放置1h/液氮放置0.5h，然后置于30℃水浴锅中，轻微振荡，使其迅速融化，此操作反复2-3次即可。
  * **超声方法：**<mark style="color:red;">冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次</mark>。
* 将提取液于4℃，1500×g离心10分钟，取上清检测。

### 2、稀释样本

* 稀释100倍：一步稀释。取<mark style="color:red;">5 μL</mark>样本到<mark style="color:red;">495 μL</mark>标准品/样本稀释液内，做100倍稀释；&#x20;
* 稀释1000倍：两步稀释。取5 μL样本到95 μL标准品/样本稀释液内，做20倍稀释，再取5 μL 20倍稀释样本到245 μL标准品&样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释1000倍；

### 3、检测前准备工作

* 提前将培养箱或摇床温度设置为<mark style="color:red;">37℃</mark>。
* 提前<mark style="color:red;">20分钟</mark>从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温(18-25℃)。如果试剂盒需分多次使用，请<mark style="color:red;">仅取出本次实验所需的酶标板条和试剂</mark>，剩余板条拆卸后放入备用铝箔袋，试剂需按照指定条件保存。
* 洗涤液：将<mark style="color:red;">浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:24)</mark>。按孔数计算所需量，洗板每孔需要<mark style="color:red;">1200μL</mark>洗涤液（每孔需要洗涤液350μL，重复洗8次）。
* 标准品工作液：
  * 将标准品于10000×g离心1分钟，加入<mark style="color:red;">标准品/样品稀释液</mark> <mark style="color:red;">1 mL</mark>至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，轻轻混匀，避免起泡，配成<mark style="color:red;">20 ng/mL</mark>的标准品工作液(或加入1 mL标准品/样品稀释液后，静置1-2分钟，用低速涡旋仪充分混匀。可通过低速离心去除涡旋过程中产生的气泡)。
  * 然后根据需要进行倍比稀释。配制成以下浓度：<mark style="color:red;">20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0</mark> ng/mL。&#x20;
  * 倍比稀释方法：取<mark style="color:red;">7支EP管</mark>，每管中加入<mark style="color:red;">500 μL</mark>标准品/样品稀释液，从20 ng/mL的标准品工作液中吸取500 μL到第一支EP管中混匀配成<mark style="color:red;">10 ng/mL</mark>的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。最后一管直接作为<mark style="color:red;">空白孔</mark>，不需要再从倒数第二管中吸取液体。 复溶后的20 ng/mL标准品工作液分装后放置-20℃保存，避免反复冻融。 倍比稀释的标准品工作液需要现配现用。

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2F8OUx0eW1Xx2qRa4S31jY%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=a3f4c7d8-ac7b-406c-98ee-947d6e841104" alt="" width="375"><figcaption></figcaption></figure>

* 生物素化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以<mark style="color:red;">100 μL/孔</mark>计算），实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟，将浓缩生物素化抗体于800×g离心1分钟，以生物素化抗体稀释液将100×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作浓度（例如：<mark style="color:red;">10 μL浓缩液+990 μL稀释液</mark>）。现配现用。
* HRP酶结合物工作液：HRP酶结合物为HRP酶结合亲和素。实验前计算当次实验所需用量（以<mark style="color:red;">100 μL/孔</mark>计算），实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟，将浓缩HRP酶结合物于800×g离心1分钟，以 酶结合物稀释液将 100×浓缩HRP酶结合物稀释成 1× 工作浓度 （例如：<mark style="color:red;">10 μL浓缩液+990 μL稀释液</mark>）。现配现用。

### 4、检测

* 分别设定 <mark style="color:red;">标准孔</mark> 、 <mark style="color:red;">空白孔</mark> 和 <mark style="color:red;">样本孔</mark> 。
  * 标准孔加入 <mark style="color:red;">100 μL</mark> 倍比稀释的标准品；
  * 空白孔加入 <mark style="color:red;">100 μL</mark> 标准品/样本稀释液；
  * 其余孔加入 <mark style="color:red;">100 μL</mark> 待测样本，建议所有的待检样本和标准品在检测中<mark style="color:red;">设立复孔</mark>；建议通过预实验确定待检样本的稀释倍数 。
* 给酶标板覆膜， <mark style="color:red;">37 ℃</mark>孵育 <mark style="color:red;">90 分钟</mark>。提 示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量<mark style="color:red;">不触及孔壁</mark>，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间宜控制在 10 分钟内。
* 在下一步骤开始前15分钟，将<mark style="color:red;">100X 生物素化抗体</mark>用生物素化抗体稀释液稀释成1×工作液（按每孔100μL计算）。
* 甩尽孔内液体，不用洗涤。用排枪在每个孔中悬空加入 <mark style="color:red;">生物素化抗体工作液 100 μL</mark> ，酶标板加上覆膜， 37℃ 温育 <mark style="color:red;">1 小时</mark>。
* 在下一步骤开始前15分钟，将<mark style="color:red;">100X HRP酶结合物抗体</mark>用酶结合物稀释液稀释成1×工作液（按每孔100μL计算）。
* 甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干残液。
* 每孔悬空加<mark style="color:red;">洗涤液 350 μL</mark> ，静置浸泡 <mark style="color:red;">1 分钟</mark>，吸去或甩掉酶标板内的液体，拍干。重复此洗板步骤 <mark style="color:red;">3 次</mark>。提示：此处与其他洗板步骤都可使用洗板机，参数设置：2点吸，每孔加入洗涤液350 μL，振板5秒，吸液0.5秒)。洗板完成后请立即进行下步操作，不要让微孔板干燥。

{% hint style="info" %}
手动洗板：甩尽酶标板内的液体后，在吸水纸上拍干（3-5次），每拍一次更换吸水纸，直至孔中心残余液体不超过5μL，同时不应用力过大使得酶标板脱落。
{% endhint %}

* 每孔悬空加 <mark style="color:red;">HRP 酶结合物工作液 100 μL</mark> ，酶标板加上覆膜 37℃ 温育 <mark style="color:red;">30 分钟</mark>。
* 甩尽孔内液体，洗板 <mark style="color:red;">5次</mark>。方法同上。
* 每孔加TMB底物溶液<mark style="color:red;">90 μL</mark> ，酶标板加上覆膜 37℃ 避光孵育 <mark style="color:red;">15 分钟</mark>左右。提示：根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过 30 分钟。当标 准孔出现明显梯度时，前 4 个显色孔出现明显蓝色梯度 ，即可终止。 提前15分钟打开酶标仪预热。
* 每孔加<mark style="color:red;">终止液 50 μL</mark> ，终止反应。提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
* 立即用酶标仪在 450 nm 波长测量各孔的光密度 (OD 值）。

### 5、结果判断

* 计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标， OD 值为纵坐标，在双对数坐标轴上拟合四参数逻辑函数的标准曲线。&#x20;
* 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。