# 免疫荧光（IF）+共聚焦 ## 实验原理 免疫荧光染色（Immunofluorescence，IF）的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括直接法和间接法。直接 法是蛋白和标记荧光素一抗结合，间接法是蛋白和一抗结合，然后再与带有荧光基团的二抗识别，荧光显微镜下即可观察到荧光。
## 实验器材 组化笔、暗盒、洗片盒/洗片架、盖玻片、共聚焦皿、微波炉、脱色摇床 ## FV31软件下载 ## 实验试剂 * 培养得当的细胞 * 适合孔径大小的细胞爬片 * 1X PBS 配置的0.2% TritonX-100 （也可以根据实验结果改成0.1% 浓度） * PBST（用100mL PBS + 0.05g Tween-20提前配置） * 1-5% BSA（用100mL PBST + 1-5g BSA提前配置） * 目的基因的一抗（rabbit anti mouse/ rat anti mouse） * 荧光二抗（donkey anti rabbit） * 含DAPI的防淬灭封片剂 ## 实验步骤 ### 1、细胞免疫荧光 #### 1）Day1：细胞铺板/放置爬片 * 制备细胞爬片：将200-500μL培养基打入24孔板中润洗，随后吸出残液；将无菌圆玻片放在24孔板中；消化分散细胞，吹打均匀，取约2\*10^5细胞，铺在玻片上【一般每孔500μL】，培养箱中培养24h，观察密度（一般培养至50-80%） * 共聚焦皿：提前1天铺板，35mm小皿铺约4-10^5\~1\*10^5个细胞。 * 如细胞贴壁较慢，可以提前2天铺皿；如细胞贴壁不牢，可采用Fibronectin或多聚赖氨酸包被。 **2）Day2：固定** * 吸去培养上清，每孔 【 贴壁 】 加PBS 500μL 【 12孔板可加1mL，后同 】，洗5min\*3 * 4%PFA每孔500μL，室温固定15min * 如果目的蛋白是膜蛋白，或蛋白亚定位与预期不符，可以尝试甲醇-20℃预冷20min，加入孔板，再-20℃固定5min。固定剂的具体选择参考下图：
#### 3）**Day2：**透化 * 500μL每孔PBS洗5min\*3 【 可以放在摇床上50rpm 】 * 每孔加0.1-0.2% TritonX-100 【 用PBS配置 】 500μL，室温透化5-15min【可以放在摇床上】，PBS洗三遍 {% hint style="info" %} TritonX-100属于强通透剂，可部分溶解细胞核膜，适合核抗原检测，不适用于细胞膜相关抗原；膜抗原可以不破膜直接先染一抗二抗，最后再破膜染DAPI {% endhint %} **4）Day2：封闭与一抗孵育** * 封闭：每孔加入5%BSA 【 100mLPBST（PBS+0.05%Tween）+ 5g BSA 】 封闭液500μL，室温封闭1h * 一抗孵育：吸去封闭液，不用PBS洗，加入100-200μL抗体/孔【用BSA溶液将1抗稀释100-1000倍】，4℃过夜 {% hint style="info" %} 可以用1mL注射器针头或尖头镊将爬片扣出，倒扣于滴加了20-50μL一抗的封口膜上，这样比较节约抗体 {% endhint %}

封口膜上孵一抗

**5）Day3：孵育二抗** * 清洗：吸去一抗，PBS洗4次，每次5min * 二抗孵育：加入二抗 【 用PBST稀释1000倍 】 ，加入100-200μL抗体/孔，室温避光孵育1h * 二抗使用前可以12000rpm离心1min，吸取上清，以避免荧光碎屑 * 清洗：吸去二抗，500μL PBS洗8-12次，每次5min **6）Day3：复染与封片** * DAPI复染与封片：用1mL注射器针头和镊子抠出细胞爬片，在载玻片上用10μL枪头滴加含DAPI的抗荧光淬灭剂，将爬片倒扣其上，显微镜观察 * 如使用DAPI溶液进行染色：取1mg的DAPI粉末，离心使粉末沉积在保存管底，后取1mL 的ddH2O将 DAPI粉末溶解，可以制备出 2.9mM的DAPI溶液（1mgDAPI/1mL H2O）。染色时1：100-1：2000进行稀释，即工作浓度为0.5-10μg/mL，室温染色10min。
### 2、冰冻切片
步骤时间原理/注意事项
1
2建立屏障
35min动作轻柔
4

固定切片

将切片从洗片缸中逐一取出，用移液枪吸取少量多聚甲醛（4%），轻轻置于切片上，使多聚甲醛覆盖住整个疏水圈。将切片置于湿盒内，室温固定20-30min

20-30min

l 原理：甲醛能形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。

l 切片组织表面不能变干，因此要逐一将切片从切片夹中取出，滴加液体。

l 多聚甲醛因为存在醛基可能会导致自发荧光，因此并不推荐，本次实验使用甲醇和多聚甲醛固定，并未发现存在很高的背景自发荧光。

l 切片固定时间较长时记得将切片置于他人不易触及的平整台面

5

洗涤

PBS清洗，5min，3次。

15min 动作轻柔
6

抗原修复

方法一：改进型柠檬酸钠修复液（50X）

  • 将抗原修复液用重蒸水或Milli-Q水稀释50倍，配制成抗原修复液(1X)。【塑料洗片缸容积220mL】
  • 抗原修复液(1X)使用前需预热到95-100℃。【微波炉大火煮沸】
  • 将切片浸泡在抗原修复液(1X)中，95-100℃加热约20分钟(加热时间可以控制在10-30分钟内，最佳的加热时间需根据不同的样品和目的蛋白自行摸索)。
  • 随后大约在20-30分钟内冷却至室温。用免疫染色洗涤液洗涤1-2次，每次3-5分钟。随后即可进行封闭等后续的免疫染色步骤。

方法二：冰冻切片快速抗原修复液（5X）

  • 将抗原修复液用蒸馏水稀释5倍，制备成1X溶液。【塑料洗片缸容积220mL，量取修复液44mL】
  • 用免疫染色洗涤液洗涤切片5 分钟。将切片浸泡在抗原修复液(1X)中，室温孵育约5 分钟。

方法一：50-60min

方法二：5min

l 加热可以使用普通的水浴锅，也可以使用微波炉加热。如果使用微波炉加热，需注意避免暴沸和过多的水分蒸发。

l 微波炉加热方法：在2L大烧杯内装乘适量水，置入塑料洗片缸，使得塑料洗片缸能够部分浸没但不浮起。大火加热，直至气泡涌出。再解冻档20min。

7

洗涤

用PBS洗涤3-5 次，每次3-5 分钟，以充分去除残留的SDS 等试剂。随后即可进行封闭等后续的免疫染色步骤。

15minSDS：十二烷基硫酸钠
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细胞通透（胞内染色）

自4度冰箱取用1%（实际用0.5%？）Triton（PBS为溶剂），室温通透10min。

10min

Triton X-100：非离子表面活性剂，破膜剂。方便染料进入核内。所具有特性：

（1）非选择性，可能会导致蛋白和脂质丢失。

（2）可破所有脂质层。

（3）高浓度或长时间孵育可能导致细胞裂解。

（4）含有苯环，故可吸收紫外光，所以如果你用紫外通道的荧光素，用这两种破膜剂可能会影响结果。

9

洗涤

PBS洗涤1次

5min
10

封闭抗原

运用二抗种属来源血清，（DOB：驴血清，3%BSA，0.1%Triton，1%Tween）封闭抗原2小时。

120min牛血清白蛋白 BSA（Bovine Serum Albumin）：封闭非特异性结合的抗原。在免疫实验中常用作封闭剂，包括ELISA、WB（Western Blot）等。
11

添加一抗

  • 配置一抗混合液：MMP14和IBA1抗体（4度冰箱小白盒），用1%BSA PBS稀释，各用5微升抗体，配成500微溶液，用于3张切片
  • 一抗（含1%BSA PBS稀释）200μL，4摄氏度过夜，一般抗体为50倍-100倍稀释。
 事先选择的特异性一抗可以与目的蛋白结合。这一步需要注意的是一抗是抗什么物种的。如果组织细胞来源是小鼠，则一抗应该是某种动物抗小鼠，这里的某种动物是指一抗宿主，比如，一抗是羊抗小鼠，羊便是一抗宿主。
12

洗涤

PBS清洗，5min，3次。

 15min 动作轻柔
13

添加二抗

  • 将10%BSA PBS稀释成1%BSA PBS溶液。
  • 配置二抗混合液：MMP14二抗（biotin连接的donkey anti rabbit抗体）1微升 + IBA1二抗（donkey anti goat 488抗体）1微升+500微升含1%BSA PBS
  • 在每张片子上添加适量二抗溶液，每片100-150微升，避光室温2h。
14

洗涤

PBS清洗3次

15min动作轻柔
15

添加链霉亲和素

将链霉亲和素用1%BSA按1：1000稀释（1μL/1mL），滴加至切片，室温孵育30min。

30min哺乳动物细胞和组织中包含依赖生物素的羧化酶，它们为多种代谢功能所需。这些包含生物素的酶类通常会在用于鉴定细胞靶标的生物素-链霉亲和素检测系统，或生物素-亲和素检测系统中产生严重的本底信号干扰。内源性生物素尤其在线粒体中和肾脏、肝脏、脑组织中广泛存在。使用生物素-链霉亲和素检测系统检测高内源性生物素水平的细胞或组织内的靶标时，内源性生物素封闭试剂盒（Endogenous Biotin-Blocking Kit，EBK）能够帮助减弱本底信号。
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洗涤

PBS清洗3次

15min动作轻柔
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染核、封片

  • 染核：在切片上滴加Dapi封片剂工作液，切勿加多！！！
  • 用盖玻片封片：盖玻片一端先抵住载玻片，用弯头镊抵住盖玻片慢慢下压，同时避免气泡。擦去溢出的多余液体。
 封片是指免疫染色后，使用固定介质将盖玻片粘附到组织切片或细胞涂片上。封片可以保护已染色的标本，以免受到物理损害。进行封片的固定介质也有助于提高显微镜下图像的清晰度和对比度。
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显微拍摄

  • 打开激光发生器。调整光圈和滤光片，1为蓝色，看DAPI，2为绿色，4为红色。
  • 镜下观察，并拍照记录（拍照时记得选择照相-印入信息，添加正确的标尺）
  • 三个通道：CX3CR1的Tdtomato发射光581nm、IBA1二抗发射光488nm、MMP14链霉亲和素发射光647nm

l 打开激光器时，慢慢增加功率，且激光打开半小时后不能关闭

l 尽早拍摄，以防止荧光湮灭

### 3、石蜡切片 #### 1）脱蜡复水： * 将载玻片置于烘干机内，65 度恒温烤片3小时（或90度1小时）。立即将载玻片插入载片架，并连续浸没于两个二甲苯缸中各 15 分钟【注意通风！盖上盖子！】。后依次置于 100%乙醇、 95%乙醇、75%乙醇中，每次10 分钟，取出置于湿盒内备用。用PBS冲洗。 #### 2）固定 * 将载玻片置于10%的中性福尔马林内20min。PBS冲洗。 #### 3）抗原修复 * 使用微波炉高火档，将1x的柠檬酸钠修复液【4ml 50x修复液+200ml水】水浴加热7/8min至沸腾（保鲜膜封住塑料切片盒，用皮筋勒紧）；将切片置于修复液内，继续用微波炉解冻模式加热15min。取出后，将塑料盒冷却至室温（可用4℃冰箱） #### 4）洗涤 * 将载玻片取出，用PBS洗涤3-5 次，每次3-5 分钟，以充分去除残留的SDS 等试剂。 #### 5）建立屏障 * 擦去玻片上多余的水分，用ImmEdge 疏水屏障笔画圈，室温放置若干分钟直至变干。将切片置于切片夹上，在缸内用冷PBS洗涤5min。 #### 6）封闭抗原 * 运用二抗种属来源血清【DOB：驴血清，3%BSA，0.1%Triton，1%Tween】或免疫荧光快速封闭液封闭抗原2小时。 #### 7）添加一抗 * 1）配置一抗混合液：PD-L1（rabbit）和CD11b抗体（rat-488），用1%BSA PBS稀释，各用10微升抗体，配成1000微溶液，用于4张切片； * 2）每个样本添加一抗（含1%BSA PBS稀释）200μL，4摄氏度过夜【一般抗体为50倍-100倍稀释】。 #### 8）添加二抗 * 1）PBS洗涤，5min，3次； * 2）配置二抗混合液：（donkey anti rabbit 594抗体）1微升 + 二抗（donkey anti rat 488抗体）1微升+500微升含1%BSA PBS； #### 9）染核、封片 * 1）PBS洗涤，5min，3次； * 2）在切片上滴加Dapi封片剂工作液，用盖玻片封片 ### 4、活细胞成像（细胞器标记） #### CellLight™ ER-GFP，BacMam 2.0内质网标记 1）细胞提前铺板至70%密度 2）每10000个细胞加入2μL BacMam2 试剂 3）细胞放置过夜（16h） 4）共聚焦成像 #### Golgi-Tracker Red （高尔基体红色荧光探针） 1）工作液的配制：取少量Golgi-Tracker Red按照1:100的比例加入到Golgi-Tracker Red稀释液中。例如取10µl Golgi-Tracker Red加入到1ml Golgi-Tracker Red稀释液中。混匀后即为Golgi-Tracker Red工作液。\ 2）去除细胞培养液，用适量的溶液如HBSS with Ca2+ & Mg2+ (Hanks' Balanced Salt Solution with Ca2+ & Mg2+)洗涤生长在盖玻片上的细胞。\ 3）去除洗涤液，加入步骤1配制好的Golgi-Tracker Red染色工作液，与细胞4℃共孵育30分钟。\ 4）回收Golgi-Tracker Red染色工作液，用冰浴预冷的细胞培养液洗涤细胞3次左右，换新鲜培养液37℃孵育30分钟。可以同时添加hoechst。\ 5）用新鲜培养液再洗涤一次，随后通常用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到高尔基体呈明亮的强荧光染色，而细胞内的其他膜系统呈比较微弱的荧光染色。 #### Tubulin Tracker™ Deep Red 使用60 µL DMSO溶解Tubulin Tracker™ Deep Red，配置为1000X贮存液，保存于-20℃； 将Probenecid溶解于1mL 含钙镁的HBSS，配置为100X贮存液； 使用含钙镁的HBSS稀释Tubulin Tracker贮存液至1×，37℃放置30min，可以同时添加1000×hoechst； 使用37℃预热的HBSS（可添加1×Probenecid减少探针流失）润洗3遍，观察。 其他活细胞染料：hoechst（细胞核）、鬼笔环肽（phalloidin）等 ### 共聚焦成像 {% file src="" %}