🧬PCR

By Kaiyi

通常用于分子克隆、基因敲除/敲入检测、小鼠基因鉴定、细胞支原体检测等。

实验原理

• PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是利用聚合酶（polymerase）在体外模拟DNA复制的过程，通过不断的扩增，使得DNA的数量呈指数级增长。

• PCR反应需要DNA模板, Primers（引物）, dNTPs（核苷酸）, PCR buffer（缓冲液）, DNA聚合酶等原料，PCR循环条件也是影响PCR实验结果的重要因素。

实验试剂

• 诺唯赞2 × Taq Plus Master Mix（Dye Plus）

• 组织裂解液

• 引物（前向引物+后向引物，需提前订制）

• EP管

• PCR管

附：试剂说明书

573KB

2 × Taq Plus Master Mix-说明书.pdf

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实验步骤

【小鼠基因型鉴定】

组织消化，提取DNA

• 用眼科剪剪取小鼠脚趾，置于1.5mL EP管中，每管加入200μL 1×Mouse Lysis Buffer和4μL Proteinase K【也可用10%NaOH】，涡旋混匀。

• 55℃水浴孵育20min后，95℃金属浴加热5min以灭活Proteinase K【注意防止EP管盖子崩开】。

• 将样品涡旋混匀后，于4℃，12000rpm离心5min，取上清用于PCR反应，剩余的DNA转移至新EP管中，置于-20℃保存。

配置PCR反应体系

• 配置PCR反应体系混合液：每个EP管需要 Mix、H2O、upstream引物、downstream引物，总体系每管20微升。

• 先计算样本管数量【N+3】，并统一配置全部样本管所需的混合液【多配10%】，充分振荡混匀。

  • 除待测样本外，一般还需设置空白对照（引物+同体积裂解液）、阳性对照（已知含有目标基因片段的小鼠DNA消化液）、阴性对照（已知不含有目标基因片段的小鼠DNA消化液）

  • 最终所需体积数=（N+3）*20μL*110%

样本管体系	内容	管数
待测定小鼠DNA样本	待测定小鼠DNA消化液	N
空白管	引物+0.25微升NaOH	1
阳性对照	已知含有目标基因片段的小鼠DNA消化液	1
阴性对照	已知不含有目标基因片段的小鼠DNA消化液	1

引物名称	引物序列
Forward
Reverse

试剂	体积（μL）
2×Taq Plus Master Mix (Dye Plus)	10
ddH2O	5
引物-F (10 µM)	1
引物-R (10 µM)	1
Template DNA【提取出的DNA】	3
总体系	20

• 将混合液依次加到各PCR管中，并加入鼠趾消化液2-3微升，用PCR管离心机振荡混匀。

PCR上机

• 将PCR管置于PCR仪内（尽量靠近中间，不要放在边缘），按照所设定的反应程序进行PCR反应【PCR程序可参考引物说明书和师兄师姐经验，也可以用PCR内程序模板】

反应程序（机动性较强）：

步骤	温度	时间	循环
1	95℃	3min	预变性
2	95℃	30s	35个
3	57℃	1min
4	72℃	1min
5	72℃	5min	彻底延伸
6	4℃	hold

配置电泳液

【PCR结束前30分钟开始配胶】

• 配置1X TAE：量筒量取980mL去离子水，20mL50x TAE，混匀溶解（TAE主要成分包含Tris/冰醋酸/EDTA）。重复配置一次，得到2L的1X TAE溶液（下一步电泳时也要用）。

• 配置琼脂糖溶液：天平称量1.5-2.0g琼脂糖，倒入锥形瓶，加入100mL 1X TAE溶液，锥形瓶盖上盖子，微波炉高火加热1.5-2min（1块大胶需75mL TAE，小胶50mL TAE）；

• 一轮加热后，戴手套取出锥形瓶，观察溶化情况，并振荡混匀；再次加热1.5min，直到琼脂糖完全溶解且液体呈完全澄清状态，不再能看见未溶解的琼脂糖颗粒；

• 待琼脂糖溶液冷却至约50-60℃时，趁热加入10000× GelRed核酸染料【也可以在反应体系中添加sybr green作为替代】，摇晃均匀。

琼脂糖电泳

• 提前清洗胶板、齿梳；组装胶板与齿梳；

• 在确认胶板水平的情况下倒入琼脂糖溶液，按压，排出气泡；

• 静候冷却（20-30分钟，时间太短则不凝，太长则会变干影响电泳），凝胶成形。拔出齿梳。

• 打开电泳槽盖子，在电泳槽中加入足量1X TAE（1.5-2L），放入凝胶（注意摆放的方向，有孔的一端朝左，电泳槽上也有箭头）。

• 上样：先在凝胶孔洞每排首尾各加2.5微升蛋白ladder 【DL500/DL2000/DL10000】，用移液枪（或排枪）在孔中滴加样本混合液，确保样品准确沉入孔底，避免气泡产生，每孔上样量约10微升。

• 盖上盖子，接通电源（红对红，黑对黑），120V电压电泳20分钟；

• 关闭电源，取下电泳槽盖子，取出凝胶，显影观察。

• 注：核酸在凝胶中的速率取决于分子大小等，分子越小，迁移速度越快。

【基因敲除/敲入鉴定】

提取DNA

• 提前铺板细胞，参照试剂盒说明书提取即可

1MB

血液细胞组织基因组 DNA 提取试剂盒.pdf

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配置PCR反应体系

试剂	体积（μL）
2×Taq Plus Master Mix (Dye Plus)	10
ddH2O	5
引物-F (10 µM)	1
引物-R (10 µM)	1
Template DNA （提取出的DNA，0.1 - 1 µg）	3
总体系	20

PCR

步骤	温度	时间	循环
1	95℃	3min	预变性
2	95℃	15s	35个cycle
3	60℃	15s	35个cycle
4	72℃	1min/kb	35个cycle
5	72℃	5min	彻底延伸
6	4℃	hold

琼脂糖电泳

步骤同上。