# PCR+琼脂糖电泳

通常用于分子克隆、基因敲除/敲入检测、小鼠基因鉴定、细胞支原体检测等。

## 实验原理

* PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是利用聚合酶（polymerase）在体外模拟DNA复制的过程，通过不断的扩增，使得DNA的数量呈指数级增长。
* PCR反应需要DNA模板, Primers（引物）, dNTPs（核苷酸）, PCR buffer（缓冲液）, DNA聚合酶等原料，PCR循环条件也是影响PCR实验结果的重要因素。

## 实验试剂

* 一般试剂包括：DNA模板（质粒、基因组cDNA、组织裂解液等）、引物（前向引物+后向引物，需提前订制）、EP管、PCR管、PCR酶（预混mix）
* 诺唯赞2 × Taq Plus Master Mix（Dye Plus）

附：试剂说明书

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* TaKaRa高保真酶

TAKARA PrimeSTAR 说明书：

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## 实验步骤

### 【小鼠基因型鉴定】

#### 组织消化，提取DNA

* 用眼科剪剪取小鼠脚趾，置于1.5mL EP管中，每管加入200μL 1×Mouse Lysis Buffer和4μL Proteinase K【也可用10%NaOH】，涡旋混匀。
* 55℃水浴孵育20min后，95℃金属浴加热5min以灭活Proteinase K【注意防止EP管盖子崩开】。
* 将样品涡旋混匀后，于4℃，12000rpm离心5min，取上清用于PCR反应，剩余的DNA转移至新EP管中，置于-20℃保存。

#### 配置PCR反应体系

* 配置PCR反应体系混合液：每个EP管需要 Mix、H2O、upstream引物、downstream引物，总体系每管20微升。
* 先计算样本管数量【N+3】，并统一配置全部样本管所需的混合液【多配10%】，充分振荡混匀。
  * 除待测样本外，一般还需设置空白对照（引物+同体积裂解液）、阳性对照（已知含有目标基因片段的小鼠DNA消化液）、阴性对照（已知不含有目标基因片段的小鼠DNA消化液）
  * 最终所需体积数=（N+3）\*20μL\*110%

| 样本管体系      | 内容                   | 管数 |
| ---------- | -------------------- | -- |
| 待测定小鼠DNA样本 | 待测定小鼠DNA消化液          | N  |
| 空白管        | 引物+0.25微升NaOH        | 1  |
| 阳性对照       | 已知含有目标基因片段的小鼠DNA消化液  | 1  |
| 阴性对照       | 已知不含有目标基因片段的小鼠DNA消化液 | 1  |

| 引物名称    | 引物序列 |
| ------- | ---- |
| Forward |      |
| Reverse |      |

| 试剂                               | 体积（μL） |
| -------------------------------- | ------ |
| 2×Taq Plus Master Mix (Dye Plus) | 10     |
| ddH2O                            | 5      |
| 引物-F (10 µM)                     | 1      |
| 引物-R (10 µM)                     | 1      |
| Template DNA【提取出的DNA】            | 3      |
| 总体系                              | 20     |

* 将混合液依次加到各PCR管中，并加入鼠趾消化液2-3微升，用PCR管离心机振荡混匀。

#### PCR上机

* 将PCR管置于PCR仪内（尽量靠近中间，不要放在边缘），按照所设定的反应程序进行PCR反应【PCR程序可参考引物说明书和师兄师姐经验，也可以用PCR内程序模板】

反应程序（机动性较强）：

<table><thead><tr><th width="90">步骤</th><th width="160">温度</th><th width="130">时间</th><th>循环</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>95℃</td><td>5min</td><td>预变性</td></tr><tr><td>2</td><td>95℃</td><td>30s</td><td>变性</td></tr><tr><td>3</td><td>58℃</td><td>30s</td><td>退火</td></tr><tr><td>4</td><td>72℃</td><td>1min/kb</td><td>延伸，×35个循环</td></tr><tr><td>5</td><td>72℃</td><td>5min</td><td>彻底延伸</td></tr><tr><td>6</td><td>4℃</td><td>hold</td><td></td></tr></tbody></table>

#### 配置电泳液

【PCR结束前30分钟开始配胶】

* 配置1X TAE：量筒量取980mL去离子水，20mL50x TAE，混匀溶解（TAE主要成分包含Tris/冰醋酸/EDTA）。重复配置一次，得到2L的1X TAE溶液（下一步电泳时也要用）。
* 配置琼脂糖溶液：天平称量1.5-2.0g琼脂糖，倒入锥形瓶，加入100mL 1X TAE溶液，锥形瓶盖上盖子，微波炉高火加热1.5-2min（1块大胶需75mL TAE，小胶50mL TAE）；
* 一轮加热后，戴手套取出锥形瓶，观察溶化情况，并振荡混匀；再次加热1.5min，直到琼脂糖完全溶解且液体呈完全澄清状态，不再能看见未溶解的琼脂糖颗粒；
* 待琼脂糖溶液冷却至约50-60℃时，趁热加入10000× GelRed核酸染料【也可以在反应体系中添加sybr green作为替代】，摇晃均匀。

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2Fv6IobEdqNoKfakmtTRVq%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=79431a7e-3069-404b-8b2a-e3bb84f9338a" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

#### 琼脂糖电泳

* 提前清洗胶板、齿梳；组装胶板与齿梳；
* 在确认胶板水平的情况下倒入琼脂糖溶液，按压，排出气泡；
* 静候冷却（20-30分钟，时间太短则不凝，太长则会变干影响电泳），凝胶成形。拔出齿梳。
* 打开电泳槽盖子，在电泳槽中加入足量1X TAE（1.5-2L），放入凝胶（注意摆放的方向，有孔的一端朝左，电泳槽上也有箭头）。
* 上样：先在凝胶孔洞每排首尾各加2.5微升蛋白ladder 【DL500/DL2000/DL10000】，用移液枪（或排枪）在孔中滴加样本混合液，确保样品准确沉入孔底，避免气泡产生，每孔上样量约10微升。
* 盖上盖子，接通电源（红对红，黑对黑），120V电压电泳20分钟；
* 关闭电源，取下电泳槽盖子，取出凝胶，显影观察。
* 注：核酸在凝胶中的速率取决于分子大小等，分子越小，迁移速度越快。

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2F3bnSIktXwmFDEehMJswr%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=e391ae74-de2b-4862-b8ad-8cf93efbf9a0" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

### 【基因敲除/敲入鉴定】

#### 提取DNA

* 提前铺板细胞，参照试剂盒说明书提取即可

{% file src="<https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FX0StGNke6Tn73iYTlres%2F%E8%A1%80%E6%B6%B2%E7%BB%86%E8%83%9E%E7%BB%84%E7%BB%87%E5%9F%BA%E5%9B%A0%E7%BB%84%20DNA%20%E6%8F%90%E5%8F%96%E8%AF%95%E5%89%82%E7%9B%92.pdf?alt=media&token=606a61d6-d4ca-46cc-813f-f20977d3365f>" %}

#### 配置PCR反应体系

| 试剂                                | 体积（μL） |
| --------------------------------- | ------ |
| 2×Taq Plus Master Mix (Dye Plus)  | 10     |
| ddH2O                             | 5      |
| 引物-F (10 µM)                      | 1      |
| 引物-R (10 µM)                      | 1      |
| Template DNA （提取出的DNA，0.1 - 1 µg） | 3      |
| 总体系                               | 20     |

#### PCR

<table><thead><tr><th width="90">步骤</th><th width="160">温度</th><th width="130">时间</th><th>循环</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>95℃</td><td>3min</td><td>预变性</td></tr><tr><td>2</td><td>95℃</td><td>15s</td><td>35个cycle</td></tr><tr><td>3</td><td>60℃</td><td>15s</td><td>35个cycle</td></tr><tr><td>4</td><td>72℃</td><td>1min/kb</td><td>35个cycle</td></tr><tr><td>5</td><td>72℃</td><td>5min</td><td>彻底延伸</td></tr><tr><td>6</td><td>4℃</td><td>hold</td><td></td></tr></tbody></table>

#### 琼脂糖电泳

步骤同上。