Seahorse代谢检测

实验原理

贴壁细胞提前一天消化离心计数，铺于XF96细胞培养微孔板，每孔100μL（约5000-10000个细胞），角落四个孔作为空白对照。将细胞板放置于培养箱中过夜，贴壁生长。悬浮细胞当天用Poly-D-lysine包被后铺板。
取20mL的XF校准液加入50mL离心管，放入37℃且无二氧化碳的敷箱中孵育过夜。
在超净台内取出全套探针板装置，从水化板上取下盖子和探针板，倒置于实验台。水化板每个孔中加入200μL无菌dd水后，将探针板归位。将探针板放入预热至37℃且无二氧化碳的敷箱中孵育。

打开相应试剂盒的铝箔袋，药管离心使粉末沉底，使用开盖器将药管打开。
用温浴后的37℃培养基，按照说明书体积加入对应药管中，并用移液器温和吹打混匀，直至充分溶解。
ECAR：
- B液：OLIGO寡霉素粉末+720μL ECAR培养基；
OCR：
- A液：OLIGO 寡霉素（ATP合酶抑制剂）粉末+630μL OCR培养基；
- B液：FCCP（质子载体）粉末+720μL OCR培养基；
- C液：ROT/AA 鱼藤酮和抗霉素A（复合物I和复合物III抑制剂）粉末+540μL OCR培养基；

取出水化好的探针板，去除盖子，将对应的加药辅助板放置于绿色探针板上。
将用于测定细胞代谢活性的ECAR/OCR的ABC溶液分别加入对应的ABC孔中。A孔加入20μL，B孔加入22μL，C孔加入25μL。D孔不需要添加，空白对照组需要加入溶液。

ECAR试剂：每个孔A液20μL葡萄糖，B液22μL（粉末+720μL ECAR培养基），C液 25μL 2-DG；

OCR试剂：每个孔A液 20μL（），B液22μL（粉末+720μL OCR培养基），C液25μL（粉末+540μL OCR培养基）；

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实验步骤

1、提前一天：细胞铺板、探针板水化（第一步）：

贴壁细胞提前一天消化离心计数，铺于XF96细胞培养微孔板，每孔100μL（约5000-10000个细胞），角落四个孔作为空白对照。将细胞板放置于培养箱中过夜，贴壁生长。悬浮细胞当天用Poly-D-lysine包被后铺板。

取20mL的XF校准液加入50mL离心管，放入37℃且无二氧化碳的敷箱中孵育过夜。

在超净台内取出全套探针板装置，从水化板上取下盖子和探针板，倒置于实验台。水化板每个孔中加入200μL无菌dd水后，将探针板归位。将探针板放入预热至37℃且无二氧化碳的敷箱中孵育。

2、实验当天：探针板水化（第二步）：

将探针板的dd水吸出，每孔加入200μL XF校准液，并将其放入敷箱中，继续水化45-60min；

3、配置培养基：

ECAR培养基：25mL培养基中吸出250μL培养基，加入250μL谷氨酰胺；

OCR培养基：配置含有1mM丙酮酸，2mM谷氨酰胺，10mM葡萄糖的培养基。97mL 专用的DMEM/1640加入各1mL的谷氨酰胺、丙酮酸、葡萄糖。

置于37℃备用。

4、配药

打开相应试剂盒的铝箔袋，药管离心使粉末沉底，使用开盖器将药管打开。

用温浴后的37℃培养基，按照说明书体积加入对应药管中，并用移液器温和吹打混匀，直至充分溶解。

ECAR：

OCR：

5、加药

取出水化好的探针板，去除盖子，将对应的加药辅助板放置于绿色探针板上。

将用于测定细胞代谢活性的ECAR/OCR的ABC溶液分别加入对应的ABC孔中。A孔加入20μL，B孔加入22μL，C孔加入25μL。D孔不需要添加，空白对照组需要加入溶液。

ECAR试剂：每个孔A液20μL葡萄糖，B液22μL（粉末+720μL ECAR培养基），C液 25μL 2-DG；

OCR试剂：每个孔A液 20μL（），B液22μL（粉末+720μL OCR培养基），C液25μL（粉末+540μL OCR培养基）；

5、上机

上机校准

上机分析