# 细胞培养注意事项

## 一、孔板的选择

* 如果培养细胞的目的是通过细胞倍增，最终获得大量细胞或细胞分泌物，则应该使用培养瓶、培养皿来培养细胞；
* 如果目的是为了进行微量的、多次的重复实验来分析细胞或细胞产物，则应该使用多孔板来培养。

### **1）选择培养瓶、培养皿培养细胞**

* 首先，根据<mark style="color:red;">期望获得的细胞产量</mark>来选择，培养瓶是通过表面积来命名的，例如T25、T75、T175，数字就是表面积，25就是25cm2，如此类推；
* 培养皿是按照其直径来命名的，例如3.5cm、9cm。不同规格的培养器皿所能培养的细胞数量见下图。

<table data-header-hidden><thead><tr><th width="166"></th><th width="186"></th><th></th><th></th></tr></thead><tbody><tr><td>培养器皿</td><td>面积（cm2）</td><td>培养液量（ml）</td><td>细胞量</td></tr><tr><td>96 孔培养板</td><td>0.32</td><td>0.1</td><td>105</td></tr><tr><td>24孔培养板</td><td>2</td><td>1.0</td><td>5×105</td></tr><tr><td>12孔培养板</td><td>4.5</td><td>2.0</td><td>106</td></tr><tr><td>6孔培养板</td><td>9.6</td><td>2.5</td><td>2.5×106</td></tr><tr><td>3.5 cm 培养皿</td><td>8</td><td>3.0</td><td>2×106</td></tr><tr><td>6 cm 培养皿</td><td>21</td><td>5.0</td><td>5.2×106</td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>55</td><td>10.0</td><td>13.7×106</td></tr><tr><td>25cm2 培养瓶</td><td>25</td><td>5.0</td><td>5×106</td></tr><tr><td>75cm2 培养瓶</td><td>75</td><td>15～30</td><td>2×107</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2F2JzphhgHFQPfjs538lGK%2F%E5%AD%94%E6%9D%BF%E9%80%89%E6%8B%A9.png?alt=media&#x26;token=5502776b-4a96-4239-a49b-977ad5a694e1" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

* 其次，根据<mark style="color:red;">实验操作熟练程度</mark>来选择，培养皿的操作比较方便，不管是换液、传代、还是收获细胞，但因为其开口很大，所以容易污染，如果你是新手，不建议直接用培养皿养细胞。
* 最后，如果选择培养瓶培养，还应该<mark style="color:red;">尽量选择有斜肩设计、带透气孔瓶盖的型号</mark>。前者可以避免培养瓶平放后，过多的培养基接触瓶盖造成污染，后者可以保持内外的二氧化碳浓度一致。如果瓶盖不透气，那在放进培养箱时，应拧松一圈，以便内外气体能顺利交换。

### 2）选择多孔板培养细胞

* 首先，也是要判断你的实验需要多少细胞来进行分析，以此来选择多孔板的规格。大家同样可以参照上面的图表。
* 有极个别的孔板，孔底部是<mark style="color:red;">锥形底或圆底</mark>，这种规格的多孔板<mark style="color:red;">适用于非组织型的细胞培养</mark>，对于大多数贴壁生长的细胞来说不适合。

### 3）培养阶段注意事项

* A. 多孔板会带板盖，但其<mark style="color:red;">密封性不好，在培养箱内会造成边缘的孔位蒸发效率</mark>过高，进而影响细胞生长速率；因此，可以在盖上板盖后在缝隙处贴一圈<mark style="color:red;">封口膜</mark>。或者<mark style="color:red;">舍弃边缘孔位</mark>，并采用添加培养基来代替。
* B. 当细胞种入孔内以后，<mark style="color:red;">不应该再进行过多的震动</mark>，例如晃动、抖动培养板，而应该轻缓的放入培养箱中。如果培养箱由多人共用，还应该考虑大家频繁开关箱门、拿放孔板造成的震动，这些不利因素都应该尽量减少。

## 二、血清、双抗和细胞因子

* 血清中含有生长因子可促进细胞繁殖，含有附着因子可促进细胞贴壁，同时还有一种特殊的活性能抵抗胰蛋白酶的消化作用。血清内含有丰富的矿物质、酯类和激素。最常见的血清包括：小牛血清、胎牛血清、成年马血清等。其中<mark style="color:red;">胎牛血清</mark>对培养要求高的细胞系效果最好。
* 血清来源于动物， 因此必定存在<mark style="color:red;">批次间的差异</mark>，且生产过程中由于工艺流程的不同，哪怕是同一类型的血清也会存在质量上的巨大差异。
* 血清的灭活是<mark style="color:red;">将血清置于56摄氏度中30分钟</mark>，然后再分装成数份保存于-20摄氏度。血清加热的目的是为了免疫分析时用于<mark style="color:red;">灭活补体</mark>，在免疫学、干细胞等培养时需要灭活。
* 在培养基中添加抗生素是一种常见的操作，其主要作用是抑制或杀死培养物中的某些细菌或真菌，从而避免它们对目标细胞的干扰和污染。在培养实验中，选择适当浓度和种类的抗生素，可以有效地消除或减少杂菌、污染菌或其他不需要的微生物，保证培养物的纯度和稳定性。但是，<mark style="color:red;">添加抗生素并不能确保你的细胞一定不被微生物污染</mark>，因操作不当造成污染的还是会被污染的。并且，一旦细胞被污染，抗生素也只能起到一定的抑制延缓作用，并不能彻底杀灭微生物。而且，长期添加抗生素的话，还容易掩盖培养环境的真实情况。
* 除了抗生素外，培养基中还可以添加细胞因子，以模拟体内环境和调节细胞功能。细胞因子是一类多肽分子或蛋白质，由细胞自身或其他细胞产生，并通过受体介导的信号转导途径影响目标细胞的增殖、分化、存活、迁移等过程。在细胞培养中，添加适当浓度和种类的细胞因子，可以促进细胞增殖和分化，提高细胞存活率和功能表现。例如，添加<mark style="color:yellow;">表皮生长因子（EGF）</mark>可以促进表皮细胞增殖和修复；添加肝细胞生长因子（HGF）可以促进肝细胞增殖和再生；添加<mark style="color:yellow;">白细胞介素-2（IL-2）</mark>可以促进T淋巴细胞增殖和活化等。

## 三、细胞培养基

* 培养基有很多不同的名字是因为根据不同细胞的培养和应用场景，培养基可以分为多种类型，最常见的是<mark style="color:red;">DMEM、RPMI-1640、MEM</mark>等。这些培养基有自己的配方特点和适用范围。例如，DMEM适用于哺乳动物细胞的培养，而RPMI-1640则适用于淋巴细胞的培养。这种培养基通常用于常见的细胞培养实验中，只要按<mark style="color:red;">照合适比例加入血清</mark>，就成为了完全培养基，就可以应用于细胞的日常培养、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等实验中。
* **DMEM**(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)是一种最广泛应用的细胞培养基之一，它是由Eagle于1959年开发出来的，后由Dulbecco进行了改良。DMEM主要适用于<mark style="color:red;">肝脏、肾脏、肺、心脏等多种类型的哺乳动物细胞系</mark>的培养。DMEM中<mark style="color:yellow;">含有较高浓度的葡萄糖（4500mg/L）、氨基酸、维生素和微量元素等营养物质。此外，DMEM还添加了丙酮酸和乳酸等缓冲剂，能够保持细胞在较宽的pH范围内正常生长</mark>。
* **RPMI-1640**(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)是一种由Roswell Park纪念研究所开发的细胞培养基，适用于<mark style="color:red;">淋巴细胞、骨髓细胞、白血病细胞</mark>等多种类型的哺乳动物细胞系的培养。

  RPMI-1640中含有<mark style="color:yellow;">较低浓度的葡萄糖（2000mg/L）、氨基酸、维生素和微量元素等营养物质</mark>。

  此外，RPMI-1640还<mark style="color:yellow;">添加了缓冲剂HEPES和碳酸氢盐，能够保持细胞在较窄的pH范围内正常生长</mark>。