⏲️细胞周期、凋亡检测

By Kaiyi

实验原理

细胞周期检测

Day0

• 提前一天铺板，12孔板，2*10^5细胞/孔。

Day1

• 洗涤：消化后转移至流式管，PBS重悬细胞，500G离心5min，弃去上清，刮匀细胞

• 每管（50μL液体）加0.5μL Fc-Block（人Fc-Block在4度冰箱蓝色盒子，小白瓶），4℃静置10min

• 分管，分出blank管，PB通道L/D单染管，PE通道PI单染管

• 每样本管及L/D单染管加0.2 μL PB L/D（-20度冰箱流式抗体盒），避光4℃静置30min

• 每管加2mL PBS，500G离心5min，弃去上清，刮匀细胞

• 每管加1mL 70%乙醇（现配，预冷），-20℃固定过夜

Day2

• 每管加2mL PBS，500G离心5min，弃去上清，刮匀细胞；重复洗涤一次

• 500μL PBS重悬细胞，加20μL RNAase A（-20冰箱），37℃避光孵育30min

• 500G离心5min，弃去上清，刮匀细胞

• 500μL PBS重悬，每管加0.5μL PI染料（-20冰箱），37℃避光孵育30min

• 不用洗涤，直接上机检测

细胞凋亡检测

• 细胞提前铺板；

• 吸取细胞上清（因为部分凋亡细胞会在细胞上清）至15mL离心管；

• PBS润洗，润洗液也收集至15mL离心管；

• 用不含EDTA的胰酶进行消化（EDTA会螯合Ca2+，进而影响Annexin V与PS的结合，导致检测结果不准确；含有EDTA的胰酶可能会进一步损伤细胞膜，产生假阳性信号）；

• 用含血清培养基终止消化后，细胞悬液加入15mL离心管，300G离心5min；

• PBS清洗2遍；

• 加入凋亡检测试剂（1× binding buffer），重悬细胞，计数，稀释至1*10^6/mL；

• 流式上机；