# 原力子显微镜（AFM）

细胞样品处理

* 耐思玻底皿（801001，35mm，20mm玻片），Fibronectin（1：100用PBS稀释，37℃ 2h）包被
* 每个皿提前24h接种2\*10^4左右个细胞，或提前48h铺板1\*10^4左右个细胞

准备物品

* 探针：MLCT-Bio-D/E针（显微镜下将其他针头敲掉）
* 空皿、PBS/HBSS液体（提前0.22μm过滤，用于校准）、移液器、1mL枪头、擦手纸
* 细胞样品皿

开机流程

* 依次打开转盘共聚焦各个控制器，等待5号灯不再闪时，打开电脑主机（7号荧光漂白不用开）
* 打开AFM的电源及电脑开关，账号jpkuser，密码jpkjpk
* 打开共聚焦VisiView软件
* 打开AFM软件（JPKSPM Desktop），选择普通扫描头（H210026）

装针

* 拿出探针、装针台、石英探针夹（双手只能拿侧面，酒精擦拭上下面）
* 确认装针台为open状态，放入探针夹，旋转，关闭
* 用十字螺丝刀拧开探针夹顶部，用镊子夹取探针，固定（部分与压片重合即可），拧紧螺丝
* 将探针夹旋转装入扫描头，使针尖朝右，卡紧
* 提起聚光镜，将扫描头小心置于转盘共聚焦上，使得三个脚与底部顶点对齐，放下聚光镜

调节激光

* 点击Show live，开启显微镜成像
* 调节显微镜准焦螺旋，直至对焦清楚探针；
* 点击zoom out 打开激光；
* 双击扫描模式（如接触模式）
* 先调节扫描头右侧旋钮控制激光左右移动，再调节前面旋钮控制激光上下移动，直至激光聚焦于探针前1/3左右，右侧sum值达到最大；调节左侧2个旋钮，直至红色激光点位于中心；如要大范围调节，按住中间按钮向内，然后调节反光镜；
* 点击zoom in，退出激光观察

放置空皿样品

* 取下扫描头
* 将铁环放入底部固定器，将带有2mL PBS/HBSS的共聚焦皿小心置入铁环，用两侧的固定臂固定住卡槽；
* 摇杆按下F2+enter解锁，左右移动摇杆（F1+enter为decoupling），直至对准样品
* 点Setup experiment界面右上角齿轮，调节z motor control，向上抬针1500，使针不会直接进入液面
* 将扫描头对准3个点，小心往下放
* 观察针尖距离液面距离
* 调节激光点位置，调节z motor control下针，直至针尖进入液面，进液面时可以观察到液面波动和激光sum值增加
* 进入液面后重新调节激光点位置，可能需要调节反光镜
* 进入液面后自动下针（set point 0.4）
* 点击左下角Laser Align中心，打开激光点，使红色激光点位于中心

校准：

* 根据软件左侧步骤，逐步Setup
* 1、Mount Cantilever：选择对应针名（如MLCT-D/E），Water
* 2、Mount Holder
* 3、Align Laser/Detector：使激光点保持在中心
* 4、右上角“三”符号点击Calibrate Manager：
  * method选择contact based
  * name: MLCT-D/E
  * setpoint: 1.0V
  * Number of scan: 5 
  * correction factor: 0.817
  * 点击Force curve settings右侧中间黄色曲线按钮，生成5条力曲线
  * z motor control向上抬100μm，再点击 run a thermo或calibrate，选择波峰
* 抬起扫描头，更换为样品，同上校准激光

进针

* 设置下针的系列参数
* Force Map：
  * Setpiont: 0.1 nN
  * Z length: 1.5-2.4 μm
  * Z speed: 2  μm/s
  * Contact time: 0 s
  * Scan size: 40 um
  * Pixels: 8\*8；16\*16；32\*32
* 再次调节左侧2个旋钮，直至红色激光点位于中心
* 先100-500μm手动下针，靠近时点击左上角“↓”箭头，直至听到蜂鸣声停止
* 将z motor control的步长设置为20μm
* 点击左上角中间开始按钮，开始扫描
* 点击右上角“三”符号，点击第一个“Line Oscilloscope”显示力曲线
* 每次结束点击红色按钮2-3次，上调探针，然后再移动摇杆控制载物台，再次调节激光点、下针、扫描
* 更换样品时，先用z motor control将针上移1000μm，再拿下扫描头，重新下针

保存

* 扫描完的文件点击save
* 最后打开目录，jpk data，export to folder