# 脂质体转染

## 实验原理

转染通常是指将核酸引入真核细胞，或者更具体地说，引入动物细胞中。Lipofectamine 2000/3000 等转染试剂转染试剂可以将各种有效载荷有效地转染到各种贴壁和悬浮细胞系中，用于质粒 DNA 转染以及基于 siRNA 和 shRNA 的基因敲除实验、基因表达研究。

## 质粒瞬转肿瘤细胞实验步骤

### 1、转染前一天

* 铺板适量细胞，培养24h，直至70-90%融合；
* 首次实验可以每组准备2个复孔，用不同lipo3000浓度进行转染；

### 2、转染当天（6孔板为例）

* 预热培养基，将培养基更换为新鲜培养基；
* 每孔准备2个EP管：
  * 管1：125μL Opti-MEM + 2.5 μg 质粒DNA + 5μL P3000（2μL/μg DNA，如果是siRNA不用加），混匀；
  * 管2：125μL Opti-MEM + 3.75/7.5μL lipo3000，混匀；
* 向lipo3000所在EP管加入DNA，室温孵育15min；
* 将DNA-lipo复合物加入细胞，可不换液；

对于6cm皿和10cm皿

|              | 6cm dish     | 10cm dish     |
| ------------ | ------------ | ------------- |
| Opti-MEM（每管） | 250μL        | 750μL         |
| Lipo 3000    | 7.5  or 15μL | 22.5 or 45 μL |
| DNA          | 5μg          | 15μg          |
| P3000        | 10μL         | 30μL          |

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FebT8IUHsojd0vYdzgsvz%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=e260b2ba-b236-44ba-964e-dbdf0e4039f2" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

## shRNA质粒瞬转实验步骤

### shRNA质粒构建

序列设计：<https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/semi-configurators/shrna?activeLink=productSearch>

步骤：<https://mp.weixin.qq.com/s/jPNGuPy7V0028yvwXwvJyw>

质粒载体：BsmBI酶切位点

{% file src="<https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FvCSuVgnngMO087OLFzCI%2Flenti-gRNA-puro%202_lzq.dna?alt=media&token=41e42d0f-8f18-43f1-8aaa-cd0c32a4086d>" %}

### 1、转染前一天

* 接种2\*10^5细胞/孔（MC38长得不快，可以加到5\*10^5）于24孔板中，加入500μL含血清DMEM培养基，培养24h，至70-80%融合
* 其他孔板的细胞密度见下表

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FoA6InWqV23fozLpManAt%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=0f00106d-41ad-4ab9-90a5-53fc24f7faa1" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

### 2、转染当天（以24孔板为例）

* 提前6-8h用Opti-MEM饥饿处理需要转染的细胞，以提升转染效率
* 配置质粒溶液：取若干EP管，每管加50μL Opti-MEM培养基与1μg DNA（公司给的是500ng/μL，加2μL即可，可适量增大剂量），混匀。【注意分组：需要有空白组，NC，GAPDH，HPD的不同分组】
* 配置转染试剂：取若干EP管，每管加入50μLOpti-MEM与2-5μL的Lipo2000，混匀，室温放置5min。
* 另取离心管，将转染试剂滴加至shRNA质粒溶液中。轻柔混匀，室温放置20min。
* 等待间隙，取10mL DMEM培养基37℃预热，在加转染试剂前吸掉原有培养基，用PBS洗一遍，加入400μL无血清DMEM培养基。
* 将混合液加至含细胞与培养基的孔中，来回轻柔摇晃，充分混合。
* 孵育4h，更换含血清培养基，去除复合物。
* 细胞继续培养24-48h。过程中注意换液。
* 所得细胞用于RNA抽提（24h）+RT-PCR以及Western Blot检测（48h）。

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2F6G3S2gWDDQneyMkEs5k6%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=ac3e2c36-6ecd-4036-8eb9-e304cfa708c2" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

### 3、转染第二天

* 在显微镜下统计表达绿色荧光的细胞，计算转染效率。
* 收集细胞，进行qPCR以及WB，检测基因表达变化【24h检测RNA水平，48h后检测蛋白水平，中途只换液不传代】。
* 选择抑制率最高的shRNA进行下一批实验。

## CRISPR RNP瞬转实验步骤

1. 在转染前 1 天，将细胞铺至 24 孔板中，1×10^5 个细胞/孔；
2. 准备 2 个 1.5 mL 规格的 EP 离心管，标记为 A 和 B；
3. A 管中加入：25 µL Opti-MEM TM (赛默飞)、36 pmol Cas9 蛋白（<mark style="color:red;">0.6μL</mark>\*10mg/mL）、36 pmol EasyEdit sgRNA（<mark style="color:red;">0.4μL</mark>\* 100 pmol/μL）， 室温孵育 15 min；
4. B 管中加入：25 µL Opti-MEMTM (赛默飞)、<mark style="color:red;">1.5</mark> µL LipofectamineTM 2000 (赛默飞)；
5. 将 A 管和 B 管中的溶液轻柔的混合，并在室温下孵育 10 min；
6. 将混合后的溶液加入 24 孔板中，50 µL/孔，将细胞置于 37℃培养箱中孵育；
7. 72 h 后收集细胞，用于测序、INDEL 检测等后续操作。