肠道/肠癌类器官培养

By Kaiyi

小鼠肠道类器官分离与培养

1）实验器材及试剂准备

器材：镊子、剪刀、刀片、70μm滤网、培养皿、EP管；48孔板在37℃预热；
试剂：PBS、PBS+1%双抗（预冷）、EDTA工作液（5mL DPBS加入EDTA原液）、基质胶（4℃融化，冰上操作）
完全培养基：DMEM-F12 + 1%青链霉素 + 10mM 谷氨酰胺 + 1mM N-乙酰半胱氨酸 + 1× B27 +生长因子+抗真菌药Primocin，现配现用，置于冰上。

生长因子

浓度

EGF

50ng/mL

Nogin

100ng/mL

R-spondin

500ng/mL

WTN3A

500ng/mL

Nicotinamide

10mM

AB301

500nM

Y-27632

10μM

PGE2

10nM

2）类器官分离培养

处死小鼠、刨开腹腔，取结肠、皿中清理肠外组织。
剪开结肠，清理粪便。预冷PBS+反复涮洗。
摊平肠道，用刀片刮去绒毛。
将结肠剪成2mm小段，放入装有PBS（含1%双抗）的15mL离心管，用5或10mL移液管反复冲洗，至上清澄清。
加入5 mL EDTA （5mM），4℃消化35min。
夹出成段肠段，装入含5mL PBS的离心管，用10mL移液管吹打10次，或用力震荡。
静置1min，待组织碎片沉底后，取上清，用70μm滤网过滤。
镜下观察，若有隐窝，则提取成功，取上清置于EP管，1200rpm离心3min（可重复若干次，分别在镜下观察，选择隐窝较多的进行后续操作）
弃去上清，加入DMEM-F12或PBS重悬，1200rpm（300G）离心2min，弃去上清（可留不超过40%的PBS在EP管中，便于混匀基质胶）。
EP管置于冰上，取基质胶放入，混匀（24孔板 50μL基质胶/孔；48孔板 15μL基质胶/孔），注意避免气泡。
铺板：枪头置于孔的中央，不要贴壁。
37℃孵育15min。
加入完全培养基（24孔板750μL，48孔板200μL）
2-3天换一次培养液。

3）类器官传代

待每孔培养基成熟时，约6-10天时，进行传代；
弃去一半培养基，加入少量PBS轻轻吹打，使基质胶融化，用吸管刮下剩余基质胶，移入EP管，300G离心2min，弃上清。
加入500μL 1mM EDTA，颠倒混匀，37℃消化3-5min，300G离心2min，弃上清。
加入500μL PBS，终止消化，300G离心2min
加入基质胶，按比例稀释，混匀，铺板。

4）共培养

类器官按传代步骤消化，加入基质胶。
免疫细胞消化、离心，弃上清后培养基重悬计数。
取1*10^5细胞于EP管，用培养基补至1mL，取100μL倍比稀释。
免疫细胞离心，弃上清，60μL含类器官的基质胶重悬，混匀，铺板。

小鼠肠道类器官的基因编辑

转染前用 5 mM 烟酰胺处理四个类器官圆顶 2-3 天。包含 crRNA 和 tracrRNA 序列的 sgRNA 获自 IDT（Alt-R 系统）。
收集类器官，洗涤基质胶，并在 1 ml 预热的 TrypLE Express Enzyme (Gibco) 中于 37°C 孵育 10 分钟，解离为单细胞。将细胞在 190g 下离心 3 分钟，重悬于含有 5 mM 烟酰胺和 10 μM Y-27632 二盐酸盐（Rock 抑制剂）（StemCell，72304）的 1 ml 完全培养基中，并接种到 48 孔板的两个孔中。
使用CRISPRmax试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行转染。简而言之，将补充有 1,250 ng Cas9 核酸酶 V3 (1081058)、240 ng sgRNA 和 2.5 μl Cas9 Reagent Plus 的 25 μl OPTImem 与含有 1.5 μl CRISPRmax 试剂的 25 ml OPTImem 混合，孵育 10 分钟，然后添加到每个孔中。将细胞在 32°C、600g 下旋转接种 1 小时，然后在 37°C 孵育 4 小时。然后收集细胞，重悬于基质胶中并铺于补充有Rock抑制剂的完全培养基中。
3 天后，通过添加补充有 10 ng ml−1 TGFβ（Peprotech，100-21C-10UG）且不含头蛋白的培养基开始选择。继续选择3代，然后从培养基中除去TGFβ。
T7核酸内切酶测定证实编辑成功。设计了不对称位于切割位点两侧的引物，以便产生可通过电泳区分的片段。使用 QuickExtract DNA 提取溶液 (Lucigen) 提取类器官 DNA，然后进行 PCR 扩增。 PCR 反应混合物由 10 μl Q5 master mix、6 μl H2O、2 μl 引物混合物和 2 μl DNA 组成。然后，将 10 μl PCR 产物与 1.5 μl 10× NEB buffer 2 和 1.5 μl H2O 混合，并在热循环仪中孵育如下：95 °C 10 分钟；从 95 °C 升至 85 °C，升温速率为 -2 °C s−1；从 85 °C 到 25 °C，升温速率为 -0.3 °C s−1。将形成的异源双链体与 2 μl T7 混合物（10 μl NEBuffer 2、10 μl T7 和 80 μl H2O）在 37 °C 下孵育 1 小时。添加 1 μl 0.5 M EDTA 终止反应。通过 2% 琼脂糖凝胶电泳分析样品。使用逆转录定量 PCR (RT-qPCR) 进行评估，Id3 表达的丧失进一步证实了 SMAD4 信号传导的废除。

小鼠肠癌类器官

在固定组织之前，分离肿瘤（包括潜在的粘膜下浸润）并在 PBS 中洗涤。用刀片将肿瘤粗略切碎，然后在 37 °C 下用含200 U/ml 胶原酶 IV 酶的DMEM消化 20 分钟。
随后，在含有 10% FBS 的 DMEM 中机械破碎处理组织碎片，用冷 PBS 洗涤并通过 100μm 和 40 μm 网过滤。
用碘化丙啶（PI）对单细胞制剂进行染色，并在 FACS Aria 流式细胞仪（BD Biosciences）中对 GFP+PI − 细胞进行分选。通常，获得大约 1,000 个细胞。
将细胞接种于一滴冷基底膜提取物 (BME) 培养基（Cultrex BME 2 型，Amsbio）中：40 μl 置于标准 24 孔板的预热 (37°C) 孔中（康宁）。
5 分钟后，小鼠肿瘤类器官培养基（高级 DMEM/F12，补充有 10 mM HEPES、Glutamax、不含视黄酸的 B-27（所有 Life Technologies）、50 ng/ml 重组人 EGF（Peprotech）、100 ng/ml 添加重组人 NOGGIN 和 1 μM galunisertib（LY2157299，见下文））。 NOGGIN 是内部生产的；在 HEK293-6E 细胞中表达为 His 标签蛋白，并在 4 °C 的 AKTAxpress 中使用 5 ml 镍亲和柱和 5 ml HisTrap HP 柱进行纯化。将蛋白质级分合并并脱盐（HiPrep 26/10 柱），并在小鼠 Apc 突变腺瘤类器官或骨形态发生蛋白 (BMP) 敏感的患者来源的类器官上进行测试，通过定量 PCR 分析 ID1 和 ID3 基因表达。在最初的传代中，MTO 培养基中添加了抗菌试剂 Normocin (InvivoGen)。
对于 MTO 传代，用 HBSS (Lonza) 洗涤基底膜提取物滴一次，并用胰蛋白酶-EDTA (Sigma) 在 37°C 下处理 20 分钟，然后机械解聚类器官片段（通过移液），直至形成单细胞得到悬浮液。用 FBS 淬灭胰蛋白酶，用 HBSS 洗涤细胞并重新铺板于温板上的冷 BME 培养基中。 MTO 在含有 50% FBS 和 10% DMSO (Sigma) 的 DMEM 中冷冻为胰蛋白酶消化的类器官（单细胞或小细胞团）。每两个月检查一次培养物是否有支原体污染。
参考文献：TGFβ drives immune evasion in genetically reconstituted colon cancer metastasis

人肠癌类器官分离与培养

实验准备

器材：镊子、剪刀、刀片、70/100μm滤网、培养皿、EP管；48孔板在37℃预热；
试剂及耗材：冰块、无钙镁DPBS、无钙镁DPBS+1%双抗（预冷）、FBS、基质胶（4℃融化，冰上操作）、DMEM-F12；
试剂盒：bioGenousTMTumor Tissue Digestion Solution（K601003），bioGenous Colorectal Cancer Organoid Kit（K2103-CR）；
紫外提前照射超净台30min。

实验步骤

1、配置消化液及培养基：

无菌条件下配制BioGenous 肿瘤组织消化液：4℃解冻Tumor Tissue Digestion Solution（K601003）。将2mL消化液B （Supplement 20X）加至 40 mL消化液A（Basal Medium）。按7-8mL每管分装置于15mL离心管。配制后的完全肿瘤组织消化液可在2-8°C储存，建议24小时内使用，或-20℃储存1月。
冰上解冻 bioGenous Colorectal Cancer Organoid 试剂盒，按相应比例在基础培养基（Basal Medium）中添加Supplement B（50x）和Supplement C（250x）。可以添加10 μM Y-27632 二盐酸盐（Rock 抑制剂），分装后置于-20℃。

2、组织处理：

在培养皿中用提前预冷的含1%双抗的DPBS反复涮洗肠癌组织3次，取EP管，用刀片或剪刀将组织剪切成体积约为1~3 mm3的碎片。
加入1mL DPBS，颠倒混匀，3000rpm（300G）离心3min。
DPBS重复洗涤一次，离心。

注意：离心时候推荐使用水平离心机（可以将EP管置于15mL离心管中离心），角转子离心机会因为受力不均导致有些细胞过度贴壁甚至破损，影响回收。

3、组织消化：

将组织加入消化液中；37℃摇床180rpm消化10-30分钟。
期间每10分钟镜检一次：取10μL消化液于培养皿中，在显微镜下观察是否消化下来细胞团。直至显微镜下可见单细胞及3~5个细胞组成的细胞团。
消化等待期间，基质胶提前4℃解冻。

注意：在此操作过程中须仔细监测消化过程，因为过度消化可能会显著降低类器官形成效率。消化过程中，可以对消化悬液进行镜检，在镜下观察到较多的单个细胞或70μm以下的细胞簇后，即可认为消化完成。

4、终止消化：

在确认消化完成的组织悬液中加入胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）至终浓度达2-5%后吹打混合均匀以终止消化。
用70/100μm滤网将上述消化产物过滤至50mL离心管（可以使用枪头适当研磨组织碎片，提高回收效率），加入DPBS冲洗若干次，4℃ 3000rpm（300G）离心5min；
观察组织颜色，红细胞较多时用ACK裂解液破红1min，加入10mL DPBS终止消化，离心，弃上清；
加1mL Basel Medium （或DMEM F12）重悬至1.5mL EP管，4℃ 3000rpm （300G）离心5min；

注意：正常组织的干细胞团块比较小，70um细胞筛即可，肿瘤组织的干细胞团块比较大需要用到100um细胞筛。

5、铺板

在冰上用100μL左右的基质胶（组织：基质胶体积比约3：7）重悬细胞沉淀，小心混匀，避免气泡；
在48孔板底中央每孔加入15μL细胞（可以画圈加），24孔板则为30μL；
将孔板置于37℃培养箱10-20min，直至基质胶凝固。48孔板贴壁添加200μL培养基（24孔板500μL），没过基质胶。
每隔3天，用预热过的培养基换液。仔细观察类器官形成情况。

6、传代

类器官培养基提前37℃预热；
用200μL枪头吹打培养基，破坏基质胶，置于1.5 mL EP管（可以若干孔合并一管），吹打混匀；
室温下250g离心3分钟；
吸取上清液，并使用类器官消化液（E238001）或机械破碎法分散类器官：
- 若使用类器官解离液进行细胞解离，将沉淀中加入 5-10倍类器官基质胶混合物体积的Organoid Dissociation Solution（类器官传代消化液），吹打混匀后在37°C条件下孵育1-8分钟。可实时取少量消化悬液于显微镜下观察消化情况，当观察到较多的单细胞或直径在50μm以下的细胞簇后，即可认为消化完成。
- 若使用机械破碎法，将沉淀重悬于1.5 mL的肿瘤类器官基础培养基中。枪头小心吹打30次，施加压力帮助类器官解离。
- 当观察到由10-50个细胞组成的小颗粒细胞混合物时，解离过程即已完成。
消化完成后，加入1 mL类器官基础培养基混匀，室温250g离心3分钟；
吸取上清液，将类器官沉淀重悬于70%体积的基质胶；
将类器官以滴状铺板在培养板底中心。铺板完成后，将培养板转移到培养箱中孵育15-25分钟。将培养基预热至37°C。当基质胶固化后，小心地将预热的培养基加到孔中。
每2天拍照观察，记录类器官形态及分布。

7、冻存

用200μL枪头吹打培养基，破坏基质胶，将悬液转移至离心管（一般每3个24孔板的孔冻存于1mL冻存液）；
200g 4℃离心3min，小心吸去上清，加入预冷的细胞冻存液（Organoid Cryopreservation Medium, E238023），吹打混匀后迅速移至冻存管，置于-80℃，一天后转移至液氮。

8、复苏

提前预热培养基，打开水浴锅，准备冰块，基质胶4℃解冻；
冻存管37℃迅速解冻，转移至离心管中，缓慢加入5-10倍体积的预热培养基；
300g离心3min，弃上清，加入培养基重悬，300g离心3min，去上清；
加入适量的基质胶，在冰上混匀，种植于24孔板中，铺板完成后，将培养板转移到培养箱中孵育15-25分钟。当基质胶固化后，小心地将预热的培养基加到孔中。

人肠道类器官基因编辑

1、CRISPR-RNP电转

2、慢病毒感染

1）制备单细胞悬液

按照原代类器官建立的方法进行类器官的建立及扩增培养；
待类器官培养到直径为 100~500μm 大小时，即可进行类器官的消化；
吸弃旧培养基，加入等体积的类器官基础培养基，用细胞刮刀或者移液管吸头尖端轻轻刮下基质胶和类器官混合物，转移至 1.5mL 离心管中，吹打 5-10 次使类器官和基质胶分离，250-300g 离心 3 min；
去除上清液并加入 5 倍于基质胶和类器官混合物体积的类器官消化液（bioGenous 类器官传代消化液或Accutase细胞消化液或TrypLE Express Enzyme），吹打混匀后置于 37℃培养箱中消化 5-10 min，取 10 μL 混合液镜检，观察是否消化成单细胞或少量小的细胞团块，用1ml移液枪反复吹打10-15 次彻底分散细胞团块，若消化不充分可适当延长消化时间；
加入 5 倍体积基础培养基吹打混匀以终止消化反应，收集至 1.5mL 离心管中进行离心清洗；
进行细胞计数后，用完全培养基重悬细胞，制备浓度为 4-6×10^5 个细胞/ml 的单细胞悬液。【培养基含有10 μM Rho 激酶抑制剂 Y-27632 】

2）慢病毒感染

方法一：在凝固的基质胶上感染
- 向12/24孔板的每个孔中加入 80μl 的预冷基质胶，并在 37℃下孵育30 min以固化基质胶；
- 将 250μl 的单细胞悬液与 250μl 的病毒颗粒（可以摸索）在 1.5ml EP管中混合。加入适量Polybrene（终浓度5μg-10μg/mL，可以选8μg/mL，即向混合液中1：1000-1：2000添加10mg/mL的Polybrene）并充分混合；
- 将 500μl 的病毒颗粒和单细胞混合物接种到固化的基质胶上。在 37℃下孵育过夜；
- 第二天（约 16 小时后），吸弃旧的培养基和病毒混合液。在附着的细胞上覆盖 60μl 的新鲜冷基质胶，并在 37℃下孵育 20 min以固化基质胶；
- 加入800μL 的类器官培养基以开始培养；

方法二：在低吸附板中感染
- 参考文献：KIT promotes tumor stroma formation and counteracts tumor-suppressive TGFβ signaling in colorectal cancer
- 制备培养基：基本培养基 + 10 μM Rock抑制剂 Y-27632 + 1.25mM N-乙酰半胱氨酸 + 8μg/ml polybrene
- 收集类器官并消化成单个细胞后，用上述培养基制备浓度为 2×10^5 个细胞/ml 的单细胞悬液，加入适量病毒悬液；
- 铺到96孔低吸附板中，37℃孵育过夜；
- 继续培养12-36小时后，如有少量细胞贴壁，可用枪头轻柔吹打下来，混匀，将细胞培养基混悬液收集至离心管中。300g 4℃富集离心5min后移去上清，添加1ml左右类器官培养基转移到1.5mL EP管，重新重悬离心，加入基质胶混匀后铺板；
方法三：离心感染
- 参考文献：Chromatin Remodeling in Patient‐Derived Colorectal Cancer Models；Genome-scale CRISPR-Cas9 screen of Wnt/β-catenin signaling identifies therapeutic targets for colorectal cancer；Genome-Scale CRISPR Screening in Human Intestinal Organoids Identifies Drivers of TGF-β Resistance；
- 将500μL类器官溶液与500μL慢病毒与1μL Polybrene在 1.5ml EP管中混合，加入12/24孔板，30℃ 600G离心60min或800G离心90min；
- 37℃孵育3-4h；
- 用枪头轻柔吹打下来，混匀，将细胞培养基混悬液收集至离心管中。300g 4℃富集离心5min后移去上清，添加1ml左右类器官培养基转移到1.5mL EP管，重新重悬离心，加入基质胶混匀后铺板；
- 添加含有10 μM Rock抑制剂 Y-27632、10μM GSK3β抑制剂CHIR-99021的培养基，增强细胞存活率和转导后恢复能力。
如果引入了表达 GFP 的载体，则在感染后 36 小时，超过 90%的细胞应变为绿色；
如果引入的载体带有某种药物抗性基因，则待类器官出现明显增殖现象（一般需要2-3天），更换含有药物的类器官培养基进行筛选（如 1-1.5 μg/ml Puromycin 、8μg/mL Bsd等），没有转染成功的类器官将会裂解凋亡，从而筛出成功转染的类器官；

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肠道/肠癌类器官培养

By Kaiyi

小鼠肠道类器官分离与培养

1）实验器材及试剂准备

器材：镊子、剪刀、刀片、70μm滤网、培养皿、EP管；48孔板在37℃预热；
试剂：PBS、PBS+1%双抗（预冷）、EDTA工作液（5mL DPBS加入EDTA原液）、基质胶（4℃融化，冰上操作）
完全培养基：DMEM-F12 + 1%青链霉素 + 10mM 谷氨酰胺 + 1mM N-乙酰半胱氨酸 + 1× B27 +生长因子+抗真菌药Primocin，现配现用，置于冰上。

生长因子

浓度

EGF

50ng/mL

Nogin

100ng/mL

R-spondin

500ng/mL

WTN3A

500ng/mL

Nicotinamide

10mM

AB301

500nM

Y-27632

10μM

PGE2

10nM

2）类器官分离培养

处死小鼠、刨开腹腔，取结肠、皿中清理肠外组织。
剪开结肠，清理粪便。预冷PBS+反复涮洗。
摊平肠道，用刀片刮去绒毛。
将结肠剪成2mm小段，放入装有PBS（含1%双抗）的15mL离心管，用5或10mL移液管反复冲洗，至上清澄清。
加入5 mL EDTA （5mM），4℃消化35min。
夹出成段肠段，装入含5mL PBS的离心管，用10mL移液管吹打10次，或用力震荡。
静置1min，待组织碎片沉底后，取上清，用70μm滤网过滤。
镜下观察，若有隐窝，则提取成功，取上清置于EP管，1200rpm离心3min（可重复若干次，分别在镜下观察，选择隐窝较多的进行后续操作）
弃去上清，加入DMEM-F12或PBS重悬，1200rpm（300G）离心2min，弃去上清（可留不超过40%的PBS在EP管中，便于混匀基质胶）。
EP管置于冰上，取基质胶放入，混匀（24孔板 50μL基质胶/孔；48孔板 15μL基质胶/孔），注意避免气泡。
铺板：枪头置于孔的中央，不要贴壁。
37℃孵育15min。
加入完全培养基（24孔板750μL，48孔板200μL）
2-3天换一次培养液。

3）类器官传代

待每孔培养基成熟时，约6-10天时，进行传代；
弃去一半培养基，加入少量PBS轻轻吹打，使基质胶融化，用吸管刮下剩余基质胶，移入EP管，300G离心2min，弃上清。
加入500μL 1mM EDTA，颠倒混匀，37℃消化3-5min，300G离心2min，弃上清。
加入500μL PBS，终止消化，300G离心2min
加入基质胶，按比例稀释，混匀，铺板。

4）共培养

类器官按传代步骤消化，加入基质胶。
免疫细胞消化、离心，弃上清后培养基重悬计数。
取1*10^5细胞于EP管，用培养基补至1mL，取100μL倍比稀释。
免疫细胞离心，弃上清，60μL含类器官的基质胶重悬，混匀，铺板。

小鼠肠道类器官的基因编辑

转染前用 5 mM 烟酰胺处理四个类器官圆顶 2-3 天。包含 crRNA 和 tracrRNA 序列的 sgRNA 获自 IDT（Alt-R 系统）。
收集类器官，洗涤基质胶，并在 1 ml 预热的 TrypLE Express Enzyme (Gibco) 中于 37°C 孵育 10 分钟，解离为单细胞。将细胞在 190g 下离心 3 分钟，重悬于含有 5 mM 烟酰胺和 10 μM Y-27632 二盐酸盐（Rock 抑制剂）（StemCell，72304）的 1 ml 完全培养基中，并接种到 48 孔板的两个孔中。
使用CRISPRmax试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行转染。简而言之，将补充有 1,250 ng Cas9 核酸酶 V3 (1081058)、240 ng sgRNA 和 2.5 μl Cas9 Reagent Plus 的 25 μl OPTImem 与含有 1.5 μl CRISPRmax 试剂的 25 ml OPTImem 混合，孵育 10 分钟，然后添加到每个孔中。将细胞在 32°C、600g 下旋转接种 1 小时，然后在 37°C 孵育 4 小时。然后收集细胞，重悬于基质胶中并铺于补充有Rock抑制剂的完全培养基中。
3 天后，通过添加补充有 10 ng ml−1 TGFβ（Peprotech，100-21C-10UG）且不含头蛋白的培养基开始选择。继续选择3代，然后从培养基中除去TGFβ。
T7核酸内切酶测定证实编辑成功。设计了不对称位于切割位点两侧的引物，以便产生可通过电泳区分的片段。使用 QuickExtract DNA 提取溶液 (Lucigen) 提取类器官 DNA，然后进行 PCR 扩增。 PCR 反应混合物由 10 μl Q5 master mix、6 μl H2O、2 μl 引物混合物和 2 μl DNA 组成。然后，将 10 μl PCR 产物与 1.5 μl 10× NEB buffer 2 和 1.5 μl H2O 混合，并在热循环仪中孵育如下：95 °C 10 分钟；从 95 °C 升至 85 °C，升温速率为 -2 °C s−1；从 85 °C 到 25 °C，升温速率为 -0.3 °C s−1。将形成的异源双链体与 2 μl T7 混合物（10 μl NEBuffer 2、10 μl T7 和 80 μl H2O）在 37 °C 下孵育 1 小时。添加 1 μl 0.5 M EDTA 终止反应。通过 2% 琼脂糖凝胶电泳分析样品。使用逆转录定量 PCR (RT-qPCR) 进行评估，Id3 表达的丧失进一步证实了 SMAD4 信号传导的废除。

小鼠肠癌类器官

在固定组织之前，分离肿瘤（包括潜在的粘膜下浸润）并在 PBS 中洗涤。用刀片将肿瘤粗略切碎，然后在 37 °C 下用含200 U/ml 胶原酶 IV 酶的DMEM消化 20 分钟。
随后，在含有 10% FBS 的 DMEM 中机械破碎处理组织碎片，用冷 PBS 洗涤并通过 100μm 和 40 μm 网过滤。
用碘化丙啶（PI）对单细胞制剂进行染色，并在 FACS Aria 流式细胞仪（BD Biosciences）中对 GFP+PI − 细胞进行分选。通常，获得大约 1,000 个细胞。
将细胞接种于一滴冷基底膜提取物 (BME) 培养基（Cultrex BME 2 型，Amsbio）中：40 μl 置于标准 24 孔板的预热 (37°C) 孔中（康宁）。
5 分钟后，小鼠肿瘤类器官培养基（高级 DMEM/F12，补充有 10 mM HEPES、Glutamax、不含视黄酸的 B-27（所有 Life Technologies）、50 ng/ml 重组人 EGF（Peprotech）、100 ng/ml 添加重组人 NOGGIN 和 1 μM galunisertib（LY2157299，见下文））。 NOGGIN 是内部生产的；在 HEK293-6E 细胞中表达为 His 标签蛋白，并在 4 °C 的 AKTAxpress 中使用 5 ml 镍亲和柱和 5 ml HisTrap HP 柱进行纯化。将蛋白质级分合并并脱盐（HiPrep 26/10 柱），并在小鼠 Apc 突变腺瘤类器官或骨形态发生蛋白 (BMP) 敏感的患者来源的类器官上进行测试，通过定量 PCR 分析 ID1 和 ID3 基因表达。在最初的传代中，MTO 培养基中添加了抗菌试剂 Normocin (InvivoGen)。
对于 MTO 传代，用 HBSS (Lonza) 洗涤基底膜提取物滴一次，并用胰蛋白酶-EDTA (Sigma) 在 37°C 下处理 20 分钟，然后机械解聚类器官片段（通过移液），直至形成单细胞得到悬浮液。用 FBS 淬灭胰蛋白酶，用 HBSS 洗涤细胞并重新铺板于温板上的冷 BME 培养基中。 MTO 在含有 50% FBS 和 10% DMSO (Sigma) 的 DMEM 中冷冻为胰蛋白酶消化的类器官（单细胞或小细胞团）。每两个月检查一次培养物是否有支原体污染。
参考文献：TGFβ drives immune evasion in genetically reconstituted colon cancer metastasis

人肠癌类器官分离与培养

实验准备

器材：镊子、剪刀、刀片、70/100μm滤网、培养皿、EP管；48孔板在37℃预热；
试剂及耗材：冰块、无钙镁DPBS、无钙镁DPBS+1%双抗（预冷）、FBS、基质胶（4℃融化，冰上操作）、DMEM-F12；
试剂盒：bioGenousTMTumor Tissue Digestion Solution（K601003），bioGenous Colorectal Cancer Organoid Kit（K2103-CR）；
紫外提前照射超净台30min。

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ColorectalCancerOrganoidKit.pdf

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实验步骤

1、配置消化液及培养基：

无菌条件下配制BioGenous 肿瘤组织消化液：4℃解冻Tumor Tissue Digestion Solution（K601003）。将2mL消化液B （Supplement 20X）加至 40 mL消化液A（Basal Medium）。按7-8mL每管分装置于15mL离心管。配制后的完全肿瘤组织消化液可在2-8°C储存，建议24小时内使用，或-20℃储存1月。
冰上解冻 bioGenous Colorectal Cancer Organoid 试剂盒，按相应比例在基础培养基（Basal Medium）中添加Supplement B（50x）和Supplement C（250x）。可以添加10 μM Y-27632 二盐酸盐（Rock 抑制剂），分装后置于-20℃。

2、组织处理：

在培养皿中用提前预冷的含1%双抗的DPBS反复涮洗肠癌组织3次，取EP管，用刀片或剪刀将组织剪切成体积约为1~3 mm3的碎片。
加入1mL DPBS，颠倒混匀，3000rpm（300G）离心3min。
DPBS重复洗涤一次，离心。

3、组织消化：

将组织加入消化液中；37℃摇床180rpm消化10-30分钟。
期间每10分钟镜检一次：取10μL消化液于培养皿中，在显微镜下观察是否消化下来细胞团。直至显微镜下可见单细胞及3~5个细胞组成的细胞团。
消化等待期间，基质胶提前4℃解冻。

4、终止消化：

在确认消化完成的组织悬液中加入胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）至终浓度达2-5%后吹打混合均匀以终止消化。
用70/100μm滤网将上述消化产物过滤至50mL离心管（可以使用枪头适当研磨组织碎片，提高回收效率），加入DPBS冲洗若干次，4℃ 3000rpm（300G）离心5min；
观察组织颜色，红细胞较多时用ACK裂解液破红1min，加入10mL DPBS终止消化，离心，弃上清；
加1mL Basel Medium （或DMEM F12）重悬至1.5mL EP管，4℃ 3000rpm （300G）离心5min；

注意：正常组织的干细胞团块比较小，70um细胞筛即可，肿瘤组织的干细胞团块比较大需要用到100um细胞筛。

5、铺板

在冰上用100μL左右的基质胶（组织：基质胶体积比约3：7）重悬细胞沉淀，小心混匀，避免气泡；
在48孔板底中央每孔加入15μL细胞（可以画圈加），24孔板则为30μL；
将孔板置于37℃培养箱10-20min，直至基质胶凝固。48孔板贴壁添加200μL培养基（24孔板500μL），没过基质胶。
每隔3天，用预热过的培养基换液。仔细观察类器官形成情况。

6、传代

类器官培养基提前37℃预热；
用200μL枪头吹打培养基，破坏基质胶，置于1.5 mL EP管（可以若干孔合并一管），吹打混匀；
室温下250g离心3分钟；
吸取上清液，并使用类器官消化液（E238001）或机械破碎法分散类器官：
- 若使用类器官解离液进行细胞解离，将沉淀中加入 5-10倍类器官基质胶混合物体积的Organoid Dissociation Solution（类器官传代消化液），吹打混匀后在37°C条件下孵育1-8分钟。可实时取少量消化悬液于显微镜下观察消化情况，当观察到较多的单细胞或直径在50μm以下的细胞簇后，即可认为消化完成。
- 若使用机械破碎法，将沉淀重悬于1.5 mL的肿瘤类器官基础培养基中。枪头小心吹打30次，施加压力帮助类器官解离。
- 当观察到由10-50个细胞组成的小颗粒细胞混合物时，解离过程即已完成。
消化完成后，加入1 mL类器官基础培养基混匀，室温250g离心3分钟；
吸取上清液，将类器官沉淀重悬于70%体积的基质胶；
将类器官以滴状铺板在培养板底中心。铺板完成后，将培养板转移到培养箱中孵育15-25分钟。将培养基预热至37°C。当基质胶固化后，小心地将预热的培养基加到孔中。
每2天拍照观察，记录类器官形态及分布。

7、冻存

用200μL枪头吹打培养基，破坏基质胶，将悬液转移至离心管（一般每3个24孔板的孔冻存于1mL冻存液）；
200g 4℃离心3min，小心吸去上清，加入预冷的细胞冻存液（Organoid Cryopreservation Medium, E238023），吹打混匀后迅速移至冻存管，置于-80℃，一天后转移至液氮。

8、复苏

提前预热培养基，打开水浴锅，准备冰块，基质胶4℃解冻；
冻存管37℃迅速解冻，转移至离心管中，缓慢加入5-10倍体积的预热培养基；
300g离心3min，弃上清，加入培养基重悬，300g离心3min，去上清；
加入适量的基质胶，在冰上混匀，种植于24孔板中，铺板完成后，将培养板转移到培养箱中孵育15-25分钟。当基质胶固化后，小心地将预热的培养基加到孔中。

人肠道类器官基因编辑

1、CRISPR-RNP电转

技术手册|对人肠器官进行基因组编辑Weixin Official Accounts Platform

Are you genome editing intestinal organoids?STEMCELLTech

2、慢病毒感染

1）制备单细胞悬液

按照原代类器官建立的方法进行类器官的建立及扩增培养；
待类器官培养到直径为 100~500μm 大小时，即可进行类器官的消化；
吸弃旧培养基，加入等体积的类器官基础培养基，用细胞刮刀或者移液管吸头尖端轻轻刮下基质胶和类器官混合物，转移至 1.5mL 离心管中，吹打 5-10 次使类器官和基质胶分离，250-300g 离心 3 min；
去除上清液并加入 5 倍于基质胶和类器官混合物体积的类器官消化液（bioGenous 类器官传代消化液或Accutase细胞消化液或TrypLE Express Enzyme），吹打混匀后置于 37℃培养箱中消化 5-10 min，取 10 μL 混合液镜检，观察是否消化成单细胞或少量小的细胞团块，用1ml移液枪反复吹打10-15 次彻底分散细胞团块，若消化不充分可适当延长消化时间；
加入 5 倍体积基础培养基吹打混匀以终止消化反应，收集至 1.5mL 离心管中进行离心清洗；
进行细胞计数后，用完全培养基重悬细胞，制备浓度为 4-6×10^5 个细胞/ml 的单细胞悬液。【培养基含有10 μM Rho 激酶抑制剂 Y-27632 】

2）慢病毒感染

方法一：在凝固的基质胶上感染
- 向12/24孔板的每个孔中加入 80μl 的预冷基质胶，并在 37℃下孵育30 min以固化基质胶；
- 将 250μl 的单细胞悬液与 250μl 的病毒颗粒（可以摸索）在 1.5ml EP管中混合。加入适量Polybrene（终浓度5μg-10μg/mL，可以选8μg/mL，即向混合液中1：1000-1：2000添加10mg/mL的Polybrene）并充分混合；
- 将 500μl 的病毒颗粒和单细胞混合物接种到固化的基质胶上。在 37℃下孵育过夜；
- 第二天（约 16 小时后），吸弃旧的培养基和病毒混合液。在附着的细胞上覆盖 60μl 的新鲜冷基质胶，并在 37℃下孵育 20 min以固化基质胶；
- 加入800μL 的类器官培养基以开始培养；

方法二：在低吸附板中感染
- 参考文献：KIT promotes tumor stroma formation and counteracts tumor-suppressive TGFβ signaling in colorectal cancer
- 制备培养基：基本培养基 + 10 μM Rock抑制剂 Y-27632 + 1.25mM N-乙酰半胱氨酸 + 8μg/ml polybrene
- 收集类器官并消化成单个细胞后，用上述培养基制备浓度为 2×10^5 个细胞/ml 的单细胞悬液，加入适量病毒悬液；
- 铺到96孔低吸附板中，37℃孵育过夜；
- 继续培养12-36小时后，如有少量细胞贴壁，可用枪头轻柔吹打下来，混匀，将细胞培养基混悬液收集至离心管中。300g 4℃富集离心5min后移去上清，添加1ml左右类器官培养基转移到1.5mL EP管，重新重悬离心，加入基质胶混匀后铺板；
方法三：离心感染
- 参考文献：Chromatin Remodeling in Patient‐Derived Colorectal Cancer Models；Genome-scale CRISPR-Cas9 screen of Wnt/β-catenin signaling identifies therapeutic targets for colorectal cancer；Genome-Scale CRISPR Screening in Human Intestinal Organoids Identifies Drivers of TGF-β Resistance；
- 将500μL类器官溶液与500μL慢病毒与1μL Polybrene在 1.5ml EP管中混合，加入12/24孔板，30℃ 600G离心60min或800G离心90min；
- 37℃孵育3-4h；
- 用枪头轻柔吹打下来，混匀，将细胞培养基混悬液收集至离心管中。300g 4℃富集离心5min后移去上清，添加1ml左右类器官培养基转移到1.5mL EP管，重新重悬离心，加入基质胶混匀后铺板；
- 添加含有10 μM Rock抑制剂 Y-27632、10μM GSK3β抑制剂CHIR-99021的培养基，增强细胞存活率和转导后恢复能力。
如果引入了表达 GFP 的载体，则在感染后 36 小时，超过 90%的细胞应变为绿色；
如果引入的载体带有某种药物抗性基因，则待类器官出现明显增殖现象（一般需要2-3天），更换含有药物的类器官培养基进行筛选（如 1-1.5 μg/ml Puromycin 、8μg/mL Bsd等），没有转染成功的类器官将会裂解凋亡，从而筛出成功转染的类器官；

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