CRISPR-KI（脂质体转染）
By Kaiyi Fu
实验原理
CRISPR-Cas9基因敲入（KI, Knock in）是指Cas9内切酶切割双链DNA时，同时提供一段与靶基因高度同源的DNA修复模板，生物体即可启动HDR修复路径，将一段外源DNA定点插入基因内部。KI的外源基因可以是具有蛋白表达功能的编码基因，可以是参与基因调控的DNA元件，也可以是一段没有功能的DNA序列等。在该修复路径中，需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异的gRNA和Cas9核酸酶一起引入细胞中。在高度同源性DNA模板存在的情况下， HDR机制可以通过同源重组将一段DNA精准地插入特定的基因组位点。
目前CRISPR/Cas9 Gene Knock in系统可用于目的基因引入点突变，从而模拟人类遗传疾病模型；或者将报告基因(如EGFP，mCherry，BFP等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因的表达跟踪目标基因的表达；亦或将功能缺失的DNA片段修复为有功能的DNA片段，即可实现基因治疗的目的。
参考：https://mp.weixin.qq.com/s/tWBEdDL4OyAgZrUgynTIXg
实验流程步骤
1、sgRNA的设计
针对目的基因的CDS的最后一部分，通过网站评分综合选择，选择效率高的sgRNA。随后将设计好的sgRNA构建到载体（例如PHB-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)）上。
2、设计donor质粒
设计并制作两端同源臂（homologous arm）：截取sgRNA靶点上游1000bp左右的序列，制作左同源臂（HA-L）；截取sgRNA靶点下游1000bp左右的序列，制作右同源臂（HA-R）。
需要注意的是根据敲入位点，donor需要补齐一些序列，如需将RFP序列插入A基因终止密码子后而sgRNA设计的位置在终止密码前10个氨基酸处，那设计donor时需要将这10个氨基酸对应的碱基序列加在左侧同源臂上。此外，donor质粒上sgRNA序列需要进行同义突变，防止重复编辑。
将需要敲入的基因序列（RFP序列等）放置于左右同源臂之间，一起合成克隆于pcDNA3.1载体上。
可选：制备ssDNA
双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）都可以作为HDR修复机制的供体模板。不过，质粒或者PCR片段这样的dsDNA供体模板存在随机整合到基因组上的风险，在准确的基因编辑上的应用是非常有限的。而ssDNA随机整合的风险则大大降低，主要插入Cas9/sgRNA复合物所靶定的位点。与此同时，由于未整合的模板不能正常表达，这样可以更容易地识别并筛选出目的细胞克隆。此外，通过电穿孔方法导入时，ssDNA供体模板对细胞的毒性也要远低于dsDNA模板。
制备ssDNA的方法：Takara Guide-it™ Long ssDNA Production System v2
3. 将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转目的细胞
用lipo转染试剂将上述两种质粒转染至目的细胞。
1、提前在6孔板内铺板细胞，待细胞贴壁且占满培养皿底面积的70%～90%。
2、转染前换液：细胞在转染前1小时左右更换新无双抗无血清培养基。
3、转染：
lipo2000转染（6孔板）：
取EP管，加入适量（150μl/孔） Opti-MEM，加入适量（5-10μl/孔）Lipo2000混匀，室温下静置5分钟。
DNA稀释液：根据DNA的种类不同，分别于EP管中加入150μl/孔Opti-MEM，再加入2μg/孔质粒（knock-in：donor质粒 1ug/孔，PX459 Cas9-sgRNA质粒 1ug/孔）DNA轻轻混匀。
将Lipo2000稀释液加入到各DNA稀释液中，轻柔混匀，室温静置30min，形成DNA-Lipo2000复合物。
将制备好的DNA-Lipo2000复合物分别加入细胞培养基中，将培养板轻轻摇动使复合物分布均匀。并在4-6h后更换完全培养基。放入37℃ 5% CO2培养箱培养24-48h。
PEI转染：
原理及步骤同瞬转293T。
每6孔板加5μL PEI 以及2 μg质粒（donor和Cas9各1 μg）。
转染时设置仅加donor质粒不加cas9质粒的对照组。
4. 抗生素筛选，检测荧光
目的基因敲入需要根据gRNA质粒里面的荧光进行筛选或者进行抗生素抗性筛选，然后通过PCR等手段检测基因是否敲入（对照组细胞在抗生素筛选1-2周后应死亡或无荧光）。
5. PCR检测基因组
为了证实在基因组DNA中敲入基因（如GFP），设计靶向GFP上游的5’同源臂和靶向GFP下游的3’同源臂的一对引物。对照PCR产物大小即可知敲入是否成功。也可以设计引物1靶向GFP上游的5'同源臂和靶向插入基因内的引物2。
6. 单克隆分选
前期工作：准备2个96孔平底板，在96孔板的四周加上100ul的PBS（含双抗），中间6×10的孔中。
稀释细胞：将细胞倍比稀释至100个/mL，取1.5mL稀释液至加样槽，加入13.5mL培养基，用排枪每孔加入加入100ul细胞悬液（平均1-2个细胞/孔）。最后用无菌的parafilm封好四周。将细胞放回培养箱中培养，等待细胞分裂增殖到超过50%汇合度（一般会需要2周时间）。
单克隆消化传代：在显微镜下确认单克隆孔，吸去培养基，加入~50μL每孔胰酶消化，再加入200μL培养基终止，平均传到两块96孔板中（150 μl每孔），一块用于传代，一块用于PCR鉴定。
单克隆鉴定：通过设计引物，利用单克隆检验试剂盒（源井生物）进行PCR，检测基因是否敲除。为进一步验证，将PCR产物送去Sanger测序。
将敲入正确的多个单克隆进行扩增并冻存。需要注意的是尽可能多留几株不同的单克隆，以免某些单克隆的细胞特征与WT细胞差异过大。
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