⚡CRISPR-KO/KI（RNP电转染）
By Kaiyi
Cas9-RNP电转原理
RNP指的是“核糖核酸-蛋白质复合物”，它由RNA和蛋白质组成。在RNP体外切割技术中，我们主要关注的是RNA引导的核酸内切酶（RGN）和CRISPR/Cas9系统中的Cas9蛋白。这两种物质协同作用，能够精确地对目标DNA进行切割。
原理：首先，设计一段与目标DNA序列互补的RNA（称为gRNA），将其与Cas9蛋白结合形成RNP。当RNP与目标DNA结合后，Cas9蛋白会在gRNA的引导下，对目标DNA进行精确切割。这样一来，我们就可以实现对特定基因的编辑、插入或删除等操作。
电转使用仪器为Neon NxT 转染仪，操作演示视频如下：
参考步骤
实验步骤
1、提前配置试剂与培养基：
Cas9蛋白分装与储存：苏州泓迅生物提供，浓度为10mg/mL，按10μL分装后，保存于-80℃，避免反复冻融。
EasyEdit sgRNA 溶解与储存：将粉末状 EasyEdit sgRNA （金斯瑞、泓迅生物、擎科等公司均可合成）用无核酸酶 TE buffer 溶解至 100 pmol/μL ，也即100μM (2nmol + 20μL TE buffer溶解)，或其他需要的浓度，按需分装，保存至-20℃，避免反复冻融，如需长期存储，保存至-80℃。
KI所需的HDR donor模板（HDRT）：将冻干粉末的dsDNA HDRT 溶解在RNase-/DNase-free 且无热原的水中，终浓度为2μg/μl，-20℃储存。
RNA化学合成：需要将设计的sgRNA序列的T改成U，在sgRNA的5’和3’端各加3个硫代和甲氧基修饰，可以提高sgRNA稳定性，并降低脱靶效应，并添加scaffold序列
配置电转后的培养基，培养箱37度预热：
对于knock-out，配置含有10%FBS但不含双抗的培养基，可添加10 μM ROCK inhibitor Y27632防止凋亡；
对于knock-in，可以向上述配置好的培养基中加入NHEJ抑制剂或HDR增强剂
例如金斯瑞GenCRISPR KI Enhancer（KIOK15），浓度为5μM，对照组添加等体积的DMSO；
或在细胞铺板30分钟后向培养基中添加1-2.5μM的Nedisertib（贮存液为10mM in DMSO，用培养基1：10000-1：4000稀释）
2、细胞铺板与预处理：
将细胞提前铺板，直至长满T25；
3、消化细胞：
正确组装好Neon NxT 电转仪电路，直至右侧出现黑色圆圈；
取状态良好的对数期生长的靶细胞（约一个T25），弃培养基，用不含钙镁的DPBS冲洗一遍，加入1mL胰酶消化，400g离心5min（悬浮细胞可直接收集）；
弃去细胞沉淀上清，用1mL 不含钙镁的DPBS重悬，计数；
对于knock-out：从细胞悬液中吸取1.5×10^6左右个细胞于无菌的1.5 mL EP管中，400g离心5min，弃上清，用 65 μL GE buffer 重悬细胞；
对于knock-in：由于HDR模板的存在，可以适当增加细胞浓度，取2*10^6左右个细胞于无菌的1.5 mL EP管中，400g离心5min，弃上清，用 65 μL GE buffer 重悬细胞；
4、制备CRISPR-Cas9 RNP复合物
细胞离心期间，准备若干EP管并标记，每条sgRNA（包括对照的sgSCR）需要1个EP管；
对于knock-out，在每个1.5 mL EP 管中分别加入：
65 μL Neon NxT Resuspension GE buffer（Thermo）
100 pmol Cas9 蛋白（1.63μL*10mg/mL）
200 pmol EasyEdit sgRNA（2μL* 100 pmol/μL）
室温下孵育 10 min（37℃ 5分钟）；
对于knock-in：
对于每条sgRNA，先分别配置上述65μL体系，室温孵育10min（37℃ 5分钟）；
从上述体系中分别吸取6.5μL另外新的EP管，在Cas9-RNP基础上再加入2μg HDR模板；
另准备一个阴性对照EP管，加入6.5μL GE buffer，但不添加RNP，只添加HDR模板；
室温继续孵育2min（或混合HDR模板后置于冰上）；
Cas9-RNP的配比：
Cas9与sgRNA比例约为1比2，如100pmol Cas9+200pmol sgRNA+100pmol ssDNA；
推荐的Cas9蛋白浓度：100pmol Cas9蛋白溶于130μL（65μLRNP+65μL细胞）体系，浓度约为120ug/1mL（0.769 nmol/L），即为推荐浓度；
推荐的sgRNA浓度：为Cas9浓度两倍，约1.54 nmol/L；
推荐的细胞浓度：推荐每10μL电转体系约包含1~2*10^5个细胞（细胞浓度一般推荐在2*10^6-1*10^7个/mL之间），130μL体系需要1.3~2.6*10^6个细胞；
推荐的HDR DNA模板浓度：33-100 nmol/L，即每13μL电转体系需要0.3-1μg的DNA；
计算：有文献推荐dsDNA浓度要达到0.5μM in 10μL，即5pmol每管（可用下列网站按照DNA分子量进行换算），800bp约对应于2ng DNA；
ssDNA的处理：
ssDNA与RNP混合前5分钟，65℃水浴5分钟破坏二级结构，立即冰浴2分钟防止复性；
5、混合细胞与Cas9-RNP复合物
对于knock-out：将65μL细胞悬液与65μL Cas9 RNP复合物悬液混匀，室温下孵育10min；
对于knock-in：向Cas9-RNP-DNA混合物中，加入6.5μL细胞悬液（2*10^5个细胞），用移液器快速轻柔吹匀；
6、电转染
将2 mL E10 buffer（适用于10μL电转体系；E100 buffer则适用于100μL体系）加入到透明的buffer tube，并插入到底座上；
用电转枪吸上10 μL电转枪头，按下白色plugger，确保金属吸头可以回弹；
电转枪小心缓慢吹匀并吸取细胞与Cas9 RNP混合物（避免气泡！！！），将带有细胞悬液的电转枪插入电击杯中，如安装对位将亮蓝灯；
设置包括电压（V）、时间（s）、脉冲次数在内的电转参数，选择正确的Buffer种类（GE buffer），对上述混合物进行电转（可以同时在同样参数下电转EGFP对照组），电转成功后亮绿灯；
对于KO，HCT116细胞推荐1600/10/3，1700/20/1，1400/20/2
对于KI，HCT116细胞推荐1400/20/2，1600/10/3，1200/10/3，930/30/2
MC38细胞在1200V-1700V电转效率均可
如电转效果不佳，可以尝试增加电压如2300/3/4，2500/2/5，但会增加细胞死亡率
从底座中拔出电转枪，将电转后的各组细胞分别转移至提前添加培养基并预热的12或24孔板中，先按蓝色ejector再按白色plugger，弃去电转枪吸头；
轻轻吹匀细胞，将细胞放置培养箱中培养；
注：一般电转 1 h 后，细胞一般可以恢复活性，膜修复会完成。但因为质粒有毒性，膜修复完成后细胞也可能会因为毒性而死去；电转后前1-2天可以添加10 μM ROCK inhibitor Y27632抗凋亡
24h后观察细胞状态，换液，将培养基换为含双抗的培养基，如有条件可根据荧光对照情况判断电转效率；
WB/qPCR检测敲除效率，进而分选单克隆。
HCT116 knock-in 电转参考文献：
mRNA电转实验步骤（T细胞）
1、复苏T细胞4h以上，将T细胞培养体系转移至50mL离心管【过滤以除去死细胞】，用opti-MEM补足50mL【此步用来洗清血清，避免影响电转效率】；
2、离心之前计数：台盼蓝：T细胞=1:1（10ul）；
3、500G 离心5min，弃去上清，弹匀；离心期间在6或12孔板（每孔最多5ml）加X-VIVO培养基，放入培养箱37℃预热。同时取出-80℃冻存的mRNA（1000ng/μL，每支10μL，可以电10*10^6细胞），待其融化至室温；
4、加1mL opti-MEM，转移至1.5ml EP管，4000rpm 2min离心，弃去上清，弹匀；
5、按上述步骤重复清洗一次；随后用800ul 1×opti-MEM重悬细胞。（认为耗损率为80%）
6、取一包RNAase free黄枪头，吹匀细胞悬液，再加入mRNA溶液混匀，在电转杯中加入100μL上述细胞液并吹匀【注意避免气泡】
7、盖上电转杯杯盖，500V 700μs电转，随后立即将其转移至12孔板中【倾斜电转杯以便吸液】，继续培养【注意用封口带封口，轻晃一下板子，37℃】，8-12h培养后测表达。
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