微管相关实验

By Kaiyi

微管稳定性（免疫荧光）

• 提前在共聚焦皿或爬片上铺板适当密度的细胞；

• 细胞用100ng/mL的诺考达唑（源叶 T92302 10mM in DMSO稀释）处理不同时间（0、15、30、45分钟），以诱导微管解聚。

• 用PEMT缓冲液洗涤盖玻片；

100ng/mL诺考达唑溶液配置：

1）1μL 10mM 诺考达唑 in DMSO（源叶 T92302 ，即3013ng）溶于1mL H2O，得到10μM（3013ng/mL）溶液

2）33μL 10μM溶液+970μL 培养基，得到含100ng/mL诺考达唑的培养基

PEMT缓冲液配置：10mL PEM缓冲液（源叶 R27733，PEM Buffer PIPES 50mM，EGTA 1mM，MgCl2 1mM，PH6.8）+ 10μL Triton X-100（0.1%）

• 使用免疫荧光染色和显微镜检查残留的微管

微管稳定性（聚合/可溶性二聚微管蛋白检测）

• 细胞用100ng/mL诺考达唑处理不同时间（0、15、30、45分钟），诱导微管解聚。

• 使用PEMT缓冲液提取可溶性蛋白质（soluble dimeric tubulin），加入四分之一体积的5× SDS。

• 将剩余的聚合物部分（polymeric tubulin）洗涤一次，加入1× SDS（RIPA）溶解。

• 通过WB检测可溶性和聚合物组分中的微管蛋白水平。

RCCD1 depletion attenuates TGF-β-induced EMT and cell migration by stabilizing cytoskeletal microtubules in NSCLC cells. Fig4A