微管相关实验

By Kaiyi

微管稳定性（免疫荧光）

• 提前在共聚焦皿或爬片上铺板适当密度的细胞；

• 参数1（低剂量NZ）：用2μM的诺考达唑处理15分钟；（Compressive forces stabilize microtubules in living cells）

• 参数2：用1μM（10mM贮存液1：10000稀释）的诺考达唑处理18h，进行免疫荧光染色；

• 参数3：细胞用100ng/mL的诺考达唑（源叶 T92302 10mM in DMSO稀释）处理不同时间（0、15、30、45分钟），以诱导微管解聚。用PEMT缓冲液洗涤盖玻片；

100ng/mL诺考达唑溶液配置：

1）1μL 10mM 诺考达唑 in DMSO（源叶 T92302 ，即3013ng）溶于1mL H2O，得到10μM（3013ng/mL）溶液

2）33μL 10μM溶液+970μL 培养基，得到含100ng/mL诺考达唑的培养基

PEMT缓冲液配置：10mL PEM缓冲液（源叶 R27733，PEM Buffer PIPES 50mM，EGTA 1mM，MgCl2 1mM，PH6.8）+ 10μL Triton X-100（0.1%）

• 使用免疫荧光染色和显微镜检查残留的微管

微管稳定性（聚合/可溶性二聚微管蛋白检测）

• 细胞用100ng/mL诺考达唑处理不同时间（0、15、30、45分钟），诱导微管解聚。

• 使用PEMT缓冲液提取可溶性蛋白质（soluble dimeric tubulin），加入四分之一体积的5× SDS。

• 将剩余的聚合物部分（polymeric tubulin）洗涤一次，加入1× SDS（RIPA）溶解。

• 通过WB检测可溶性和聚合物组分中的微管蛋白水平。

RCCD1 depletion attenuates TGF-β-induced EMT and cell migration by stabilizing cytoskeletal microtubules in NSCLC cells. Fig4A

微管再生实验

• 1 day prior the experiment we plated the cells in 35 mm dishes.

• To depolymerize microtubules, we incubated the cell dishes on ice for 35 min.

• For drug treatment, 2 µM Tubacin or 0.04% (v/v) DMSO as control were added to the cells in fresh culture medium after 10 min of cold treatment and cells were continued to incubate for another 25 min on ice. Subsequently at the transition from cold to warm treatment (0 min condition) or after 5, 10, 15 or 30 min incubation at 37°C for microtubule to regrowth, cells were fixed and immuno-stained (as described for Immunofluorescence) or lysed (as described for SDS-PAGE and Western blot).

• 参考文献：Microtubule damage shapes the acetylation gradient