质粒转化、扩增、提取

By GYY, Kaiyi

基本原理

实验步骤

实验前2天：质粒转化

提前配置LB培养基：
- LB液体培养基：250mLH2O加6.25gLB肉汤粉末（25g/L），加封口膜，高压蒸汽灭菌
- LB固体平板的制备：250mLH2O加10gLB琼脂粉末（40g/L），加封口膜，高压蒸汽灭菌，降至接近37℃时，加入抗生素如1000X的氨苄，倒之于10cm圆皿（每皿20-30mL），凝固后倒置于4℃冰箱。

抗生素配置：超净台内

1、卡那霉素（Kana）：0.5g Kana粉末+10mL灭菌水——》过0.22μm滤膜——》分装至1.5mL离心管——》保存于-20℃。

母液浓度：50mg/mL
工作浓度：50μg/mL，即每100mLLB培养基加100μL卡那霉素（如果是10mg/mL的即用型溶液，按1：200稀释，即每200mL加1mL）

2、氨苄青霉素（Amp）：1g Amp粉末+10mL灭菌水——》过0.22μm滤膜——》分装至1.5mL离心管——》保存于-20℃。

母液浓度：100mg/mL
工作浓度：100μg/mL，即每100mL LB培养基加100μL氨苄青霉素

将金属浴预热至42℃，用烘箱37℃预热LB固体平板（加抗生素）和LB液体培养基（不加抗生素）
从-80冰箱取一管Top10/DH5α感受态细胞（一管100μL，一般一个质粒30μL够了），在冰上解冻
测量质粒DNA浓度，稀释为1ng/μL【干粉盖子打开前，先用12000g离心一分钟，ddH2O溶解】
取1ng DNA（1μL），加入30μL感受态细胞中，轻弹管壁，冰上放置30min（不要吹打）
感受态细胞42℃热激1min
冰上孵育2min
向管内加入600μL预热的LB液体培养基（不含抗生素），吹打混匀
将管子置于孔板上，37℃，225rpm摇菌1h
5000rpm离心1min，弃去上清，用100μL培养基重悬
在LB固体平板（再三确认载体抗性！！！）内加入重悬的菌液，用涂布棒涂布，室温放置2min，使其充分吸收
待菌液吸收，倒置平板，37℃培养16h，可放置于4℃保存。

实验前一天：摇菌（单菌落大量扩增）

生物安全柜内、酒精灯旁，准备若干离心管（小提用15mL离心管+5毫升培养基；中提用50mL离心管），每管加一定量培养基配制所需要的选择性培养基（如5mL培养基加5μL的1000X氨苄青霉素）；
酒精灯旁，用加样枪挑菌落，则选择100μL黄枪头，挑完直接把抢头打进管子里。
37℃温箱内固定在摇床上，盖子不能盖紧，220rpm振摇过夜【16个小时】。
第二天培养基变得混浊，说明细菌生长良好。

质粒提取（小提）

目的：对于1mL-5mL的菌液中质粒DNA进行小量提取，每管最终获得10微克质粒，可用来进行常规的载体构建实验（会有内毒素且量太少，不推荐用于包病毒）

前期：在超净台内，15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记，挑取单菌落接种。37℃、180rpm过夜培养。
保甘油菌：30%灭菌甘油200μL与200μL菌液1：1混合，-80℃保存于冻存管。
超净台内，准备1.5mL 灭菌EP管，将菌液转移到EP管内，留一管或两管先不转移。
根据试剂盒步骤完成质粒小提。

质粒小提试剂盒是Forgene General Mini Kit

质粒提取（中提）

目的：质粒小提的基础上进一步去除菌液中的内毒素，获得的质粒可以用于细胞转染。

挑取单菌落接种于具有相应抗性的LB培养基的250mL锥形瓶中，37℃、180rpm过夜培养；
第二天取出锥形瓶，50mL离心管分装，4℃ 2000g（rcf）离心10min，沉淀即为细菌；
离心等待时，将Buffer P3提前置于4℃冰箱预冷；
用6mL Buffer P1重悬细菌（Buffer P1需要提前添加RNase A和LyseBlue，于4℃存放）；
再加入6 mL Buffer P2，上下翻转4-6次混匀（此时混合液变为蓝色），室温静置5min；
加入6mL 预冷的Buffer P3，上下翻转4-6次混匀（此时混合液变为无色，会有乳白色絮状沉淀）；
将裂解液倒入滤筒（QIAfilter Cartridge）中，不插入活塞，室温孵育10min；
等待静置期间，在架子上放置过滤柱（HiSpeed Tip），在架子下放置接液容器，向柱子中加入4mL Buffer QBT，等待液体从下端流净；
QBT流净后，向滤筒内插入活塞，将裂解液打入过滤柱；
使用20mL的Buffer QC清洗柱子，等待期间可以先量取异丙醇与70%乙醇；
柱子下放置15mL收集管，使用5mL Buffer QF洗脱DNA；
向收集管中加入3.5mL异丙醇（927门后柜子）沉淀DNA，混匀孵育5min；
把20mL注射器与收集膜（QIAprecipitator）相连，将上述液体倒入注射器中，插入活塞，使用恒力推动活塞挤出液体，尽量挤净；
加入2mL 70%乙醇清洗收集膜一次，并空吹几次，尽量排尽乙醇（注意不要用力过度！收集膜可能会裂！）；
将收集膜与5mL 注射器相连，使用500 μL Buffer TE清洗收集膜2次，用1.5mL离心管收集DNA。（TE可能会影响下一步的酶促反应，可换成ddH2O来收集）；
使用Nano Drop系统测量回收产物浓度，注意使用相应的溶液做Blank；

试剂盒是QIAGEN plasmid mid kit，使用方法详见说明书，其他品牌试剂盒同理。

Previous常用细胞操作 NextPCR

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实验步骤

实验前2天：质粒转化

提前配置LB培养基：

LB液体培养基：250mLH2O加6.25gLB肉汤粉末（25g/L），加封口膜，高压蒸汽灭菌
LB固体平板的制备：250mLH2O加10gLB琼脂粉末（40g/L），加封口膜，高压蒸汽灭菌，降至接近37℃时，加入抗生素如1000X的氨苄，倒之于10cm圆皿（每皿20-30mL），凝固后倒置于4℃冰箱。

抗生素配置：超净台内

1、卡那霉素（Kana）：0.5g Kana粉末+10mL灭菌水——》过0.22μm滤膜——》分装至1.5mL离心管——》保存于-20℃。

母液浓度：50mg/mL
工作浓度：50μg/mL，即每100mLLB培养基加100μL卡那霉素（如果是10mg/mL的即用型溶液，按1：200稀释，即每200mL加1mL）

2、氨苄青霉素（Amp）：1g Amp粉末+10mL灭菌水——》过0.22μm滤膜——》分装至1.5mL离心管——》保存于-20℃。

母液浓度：100mg/mL
工作浓度：100μg/mL，即每100mL LB培养基加100μL氨苄青霉素

将金属浴预热至42℃，用烘箱37℃预热LB固体平板（加抗生素）和LB液体培养基（不加抗生素）

从-80冰箱取一管Top10/DH5α感受态细胞（一管100μL，一般一个质粒30μL够了），在冰上解冻

测量质粒DNA浓度，稀释为1ng/μL【干粉盖子打开前，先用12000g离心一分钟，ddH2O溶解】

取1ng DNA（1μL），加入30μL感受态细胞中，轻弹管壁，冰上放置30min（不要吹打）

感受态细胞42℃热激1min

冰上孵育2min

向管内加入600μL预热的LB液体培养基（不含抗生素），吹打混匀

将管子置于孔板上，37℃，225rpm摇菌1h

5000rpm离心1min，弃去上清，用100μL培养基重悬

在LB固体平板（再三确认载体抗性！！！）内加入重悬的菌液，用涂布棒涂布，室温放置2min，使其充分吸收

待菌液吸收，倒置平板，37℃培养16h，可放置于4℃保存。

实验前一天：摇菌（单菌落大量扩增）

生物安全柜内、酒精灯旁，准备若干离心管（小提用15mL离心管+5毫升培养基；中提用50mL离心管），每管加一定量培养基配制所需要的选择性培养基（如5mL培养基加5μL的1000X氨苄青霉素）；

酒精灯旁，用加样枪挑菌落，则选择100μL黄枪头，挑完直接把抢头打进管子里。

37℃温箱内固定在摇床上，盖子不能盖紧，220rpm振摇过夜【16个小时】。

第二天培养基变得混浊，说明细菌生长良好。

质粒提取（小提）

前期：在超净台内，15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记，挑取单菌落接种。37℃、180rpm过夜培养。

保甘油菌：30%灭菌甘油200μL与200μL菌液1：1混合，-80℃保存于冻存管。

超净台内，准备1.5mL 灭菌EP管，将菌液转移到EP管内，留一管或两管先不转移。

根据试剂盒步骤完成质粒小提。

质粒小提试剂盒是Forgene General Mini Kit

质粒提取（中提）

目的：质粒小提的基础上进一步去除菌液中的内毒素，获得的质粒可以用于细胞转染。

挑取单菌落接种于具有相应抗性的LB培养基的250mL锥形瓶中，37℃、180rpm过夜培养；

第二天取出锥形瓶，50mL离心管分装，4℃ 2000g（rcf）离心10min，沉淀即为细菌；

离心等待时，将Buffer P3提前置于4℃冰箱预冷；

用6mL Buffer P1重悬细菌（Buffer P1需要提前添加RNase A和LyseBlue，于4℃存放）；

再加入6 mL Buffer P2，上下翻转4-6次混匀（此时混合液变为蓝色），室温静置5min；

加入6mL 预冷的Buffer P3，上下翻转4-6次混匀（此时混合液变为无色，会有乳白色絮状沉淀）；

将裂解液倒入滤筒（QIAfilter Cartridge）中，不插入活塞，室温孵育10min；

等待静置期间，在架子上放置过滤柱（HiSpeed Tip），在架子下放置接液容器，向柱子中加入4mL Buffer QBT，等待液体从下端流净；

QBT流净后，向滤筒内插入活塞，将裂解液打入过滤柱；

使用20mL的Buffer QC清洗柱子，等待期间可以先量取异丙醇与70%乙醇；

柱子下放置15mL收集管，使用5mL Buffer QF洗脱DNA；

向收集管中加入3.5mL异丙醇（927门后柜子）沉淀DNA，混匀孵育5min；

把20mL注射器与收集膜（QIAprecipitator）相连，将上述液体倒入注射器中，插入活塞，使用恒力推动活塞挤出液体，尽量挤净；

加入2mL 70%乙醇清洗收集膜一次，并空吹几次，尽量排尽乙醇（注意不要用力过度！收集膜可能会裂！）；

将收集膜与5mL 注射器相连，使用500 μL Buffer TE清洗收集膜2次，用1.5mL离心管收集DNA。（TE可能会影响下一步的酶促反应，可换成ddH2O来收集）；

使用Nano Drop系统测量回收产物浓度，注意使用相应的溶液做Blank；

试剂盒是QIAGEN plasmid mid kit，使用方法详见说明书，其他品牌试剂盒同理。