💈Western Blot
By Jiayue & Kaiyi
实验原理
Western Blot即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。总体来说有5个步骤，蛋白电泳，转膜，封闭，加抗体，以及检测。WB前还需提取蛋白。
蛋白提取
蛋白电泳
SDS电泳能把蛋白质解聚后，在恒定pH缓冲系统中，根据蛋白质解聚后亚基分子质量大小分离。想要实现这个功能，主要依据蛋白质解聚、电泳2个原理。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳移速受3个因素的影响：分子量大小、蛋白质的形状、附带的电荷量。而SDS电泳中，对样品处理使用的两种试剂，起到关键作用。
SDS，十二烷基硫酸钠，是常用于蛋白质的变性剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级、三级结构。同时也是阴离子去污剂，和解聚的多肽链形成带大量负电的蛋白质-SDS胶束。
另一个是还原剂，常用的β-硫基乙醇、二硫苏糖醇（DTT），作用是使蛋白质半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
至此，蛋白质的形状被解除，变成多肽链；附带电荷变成大量的负电荷，原有电荷的差距几乎不计。带负电的SDS-蛋白质胶束在电场作用下，被电泳槽上方的负极排，向下方正极移动。所以，SDS-蛋白质胶束在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率，仅与测定蛋白质亚基的分子量大小有关，呈线性关系。
转膜
转膜是将蛋白质从胶里面转移到膜上，使后续更容易与抗体结合。由于SDS与蛋白结合后使蛋白带负电荷，在电场的作用下，蛋白从负极向正极移动，转印到膜上，使蛋白后续能够更好地和抗体结合。
常用的膜有尼龙膜、NC膜（硝酸纤维素膜）和PVDF膜，对蛋白质具有高度亲和性，可以根据需求来选择。
由于电场垂直于凝胶和膜，所以凝胶中的蛋白（带负电）向紧贴着凝胶的膜上转移，最终吸附在膜的表面
滤纸：维持transfer buffer稳定流动。 里面会加甲醇：当蛋白从凝胶中出来后，使蛋白与SDS分离，阻止其继续移动，从而更好地与膜结合。
封闭与显影
由于NC膜和PVDF膜都具有高度的蛋白结合力，所以封闭这一步非常重要。封闭的作用是使封闭膜上没有目的蛋白或抗原的空白位置，防止与抗体的非特异性结合。非特异性结合会导致高背景的产生，影响目的蛋白的检测。脱脂牛奶或BSA（胎牛血清）虽然也会在一定程度上吸附到目标蛋白上，但都属于非特异性的结合，很容易在后面的漂洗中消除
然后一抗与印迹膜上的目的蛋白特异性结合，而被标记了HRP（辣根过氧化物酶）的二抗与一抗特异性结合。加入HRP的底物后，HRP会引起化学发光，使用专用仪器进行成像后，就可以进行目的蛋白或抗原的定性或定量分析。
抗原抗体免疫反应
1）一般先加一抗：与蛋白特异性结合，常用的孵育时间和温度是4℃摇床过夜赋予（温度适宜，分子运动温和）。洗膜：未结合一抗洗掉。
2）二抗：被HRP辣根过氧化物酶标记（可与发光底物相结合）的抗体：可结合多个二抗，放大信号。同样也是孵育后洗膜。
实验试剂
实验步骤
1、收集细胞或组织：
培养瓶的细胞：将1 × 10^7个细胞，以500 g的速度在4℃离心2分钟，吸除培养基，再用培养基重悬细胞并离心，重复两次以去除死细胞。之后用冷的PBS洗3遍细胞，转移到1.5 ml离心管中，离心吸除PBS，细胞沉淀可以直接用于获取细胞中蛋白或保存于-80℃。
孔板中的细胞：弃去培养基，PBS洗涤；
组织：无菌PBS冲洗，冰上分离组织，切成合适大小，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，高速匀浆机匀浆。
2.1、可溶性总蛋白提取（简单版）
提前打开金属浴至95℃。
用ddH2O和5X SDS配置1X SDS溶液。
取若干EP管，标记。将1X SDS加入6孔板，每孔200μL，吹打混匀（一开始可能较粘稠，吹匀后阻力降低）后，吸到EP管（如仍然粘稠，可以超声处理）。
将EP管95℃金属浴5min，即可准备上样，或置于-80℃冰箱。
2.2、可溶性总蛋白提取（复杂版）
取一颗PPI（蛋白酶磷酸酶抑制剂，Pierce™ Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets，避光放置于4℃冰箱）加1mL RIPA裂解液配成10×裂解液（RIPA buffer 4℃保存）【也可以直接加10mL RIPA直接用】，用的时候用RIPA再稀释为1x裂解液，多余的分装冻存于-20℃;
倒掉孔板内培养基，用PBS洗一遍（贴壁加，避免冲击细胞，PBS尽量吸干并且晾干，否则影响下一步体积）
取碎冰，6孔板每孔加100/150/200ul RIPA（含1%的PMSF），在冰上裂解10min，用刮板刮孔底，把液体都刮下来（把板子倾斜起来刮），用移液枪把液体转移到EP管。
离心机4℃提前预冷。
EP管过超声，40%功率，超声开五秒停五秒，超声三次，操作时周围要有冰，超声过程中尽量避免起泡，换一个样本清水洗一次，用纸把管子擦干再超声下一个样本。
离心，4℃，14000rpm，15min。
将EP管中的上清转移到另一干净的EP管中，每个EP管尽量固定吸一样的量。若测蛋白浓度，可取适量用BCA试剂盒测定蛋白浓度。
打开金属浴，100℃预热。
2.3、组织蛋白提取
准备样本数量2倍的EP管，标记，每个EP管加2-3颗研磨珠；配置裂解液（RIPA+1/100 PMSF）；研磨机和离心机提前预冷；
用剪刀或刀片剪取绿豆大小的组织（20mg），置于EP管，置于冰上；
每个EP管加入250μL裂解液（裂解液体积：组织体积=10：3），开启研磨机（Shake time 1min，Hold time 1min，4 ℃，6.50m/s），如果研磨不充分再重复若干次；
静置后，在4℃ 12000rpm离心15min，取200μL上清至另一标记好的离心管。
冰上裂解20-30min。
取部分蛋白BCA蛋白定量。
其余蛋白原液于新的EP管中，按1:5加入的loading buffer。100℃ 煮样10min。-80℃条件保存。
2.4、胞核-胞质蛋白提取
1）赛默飞试剂盒（NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents，#78833）
准备工作：
离心机4℃预冷；
试剂盒置于冰上熔解；
准备冰块、PBS、PMSF（100X）、5×SDS，离心管若干；
细胞（2 × 10^6个）胰酶消化后，500G离心5min；
PBS清洗一遍，500G离心3min；
用枪头尽可能吸去上清；
取2个EP管，分别加入200μL CER Ⅰ 与 100μL NER，各自加入2μL与1μL的100X PMSF，置于冰上；
向细胞沉淀加入200μL CER Ⅰ ，最高速涡旋15s，冰浴10min；
加入11μL CER Ⅱ，最高速涡旋5s，冰浴1min；
最高速涡旋5s，4℃ 16000G离心5-10min；
立刻将上清（胞质提取物，cytoplasmic extract）吸至1个新的EP管，避免吸至沉淀，冻于-80℃或直接加入50μL 5×SDS；
瞬离，用10μL枪头尽可能吸净液体（可加少量PBS再润洗再吸干），加入100μL NER，最高速涡旋15s，置于冰上；
每隔10分钟，最高速涡旋15s，共计40分钟（4次）；期间离心机4℃预冷；
4℃ 16000G离心10min；
立即将上清（胞核提取物，nuclear extract）吸至1个新的EP管，直接冻于-80℃或直接加入12μL 5×SDS；
胞质和胞核蛋白提取物95℃加热10min，冻于-80℃。
2）碧云天试剂盒
步骤大致相同。
准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF（分装的PMSF是100mM的），使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF， 使PMSF的最终浓度为1mM。
对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细 胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋 白。
2.5、线粒体提取
提前准备好离心管、冰盒、冰块、800μL试剂A、1300μL试剂C，向试剂A和试剂C中加入1%体积（8μL，13μL）的100X PMSF。离心机4℃预冷。
准备2 × 10^7个细胞（1个T75），弃去培养基，用细胞刮板刮除贴壁细胞，将细胞悬浮液在一个2.0毫升微量离心管中，850g离心2分钟。小心地移除并丢弃上清液。
加入800微升线粒体分离试剂A。以中等速度vortex5秒，并在冰上精确孵育2分钟。 注意：不要超过2分钟的孵育时间。
加入10微升线粒体分离试剂B。以最大速度vortex5秒。
在冰上孵育5分钟，每隔1分钟以最大速度vortex一次。
加入800微升线粒体分离试剂C。反复倒转管子几次以混合（不要vortex！）。
在4°C下以700 × g的速度离心10分钟。
将上清液转移到一个新的2.0毫升管中，并在4°C下以12,000 × g的速度离心15分钟。 注意：为了获得更纯净的线粒体组分，减少50%以上溶酶体和过氧化物酶体杂质，以3000 × g的速度离心15分钟。
将上清液（细胞溶质组分）转移到新的管子中。沉淀物中包含分离的线粒体。
向沉淀中加入500微升线粒体分离试剂C，并在12,000 × g的速度下离心5分钟。丢弃上清液。
在进行下游处理之前，保持线粒体沉淀在冰上。冻结和解冻可能会影响线粒体的完整性。
加入5X的SDS-PAGE，混匀，95℃煮5分钟。
3、BCA法测定蛋白浓度
【碧云天试剂盒】
蛋白标准品的准备 a. 取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。 b. 取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20µl 25mg/ml蛋白标准，加入980µl稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9% NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20℃长期保存。
BCA工作液配制 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5mlBCA试剂A加100μl BCA试剂B，混匀，配制成5.1ml BCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定
蛋白浓度测定 a. 将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl【孔板提的蛋白可以1：20稀释，组织蛋白可以1：100稀释】，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。 b. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20μl，需加标准品稀释液补足到20μl。请注意记录样品体积。 c. 各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30分钟。 【注: 也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间】 d. 用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长的吸光度。 e. 根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
【Thermo试剂盒】
配置梯度稀释的BSA标准品：BSA原液已经按80μL每份分装于EP管内。
A
20μL原液
2mg/mL
B
10μL
30μL原液
1.5mg/mL
C
20μL
20μL原液
1mg/mL
D
10μL
10μL B液
0.75mg/mL
E
20μL
20μL C液
0.5mg/mL
F
20μL
20μL E管
0.25mg/mL
G
20μL
20μL F管
0.125mg/mL
H
40μL
10μL G管
0.025mg/mL
I
40μL
0
计算所需的BCA工作液体积【（标准品个数+待测样本数）×复孔数（一般2-3个）×200μL/孔），将试剂A与试剂B按50：1混合，配成BCA工作液；
如下图，向96孔板中的每个孔加入20μL的标准品/蛋白样本液（可以用PBS稀释五倍），以及200μL的BCA工作液，混匀，37℃孵育30min；
打开酶标仪，测定562nm处的吸光值，并记录读数；
用各个标准品和待测蛋白质样本的吸光值减去空白标准品的吸光度；
用空白校正的平均吸光值作图，绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。如果所得到的蛋白不在标准曲线范围内，则稀释后再重新测定。【一般蛋白上样量推荐在30μg】
4、蛋白变性
每个样本管加四分之一体积的5X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（分装后放置于-20℃冰盒内），例：200ul上清加50 ulSDS，vortex，瞬离。
100℃加热5min，加热后冰上放置5min，再加热5min，再冷却。 【加热是为了蛋白变性，防止降解，便于与SDS结合】
如果没有立刻上样，短期放4℃，长期放-80℃。
上样前再次离心，4℃，14000rpm，1min，让杂质沉淀在底部（保持实验稳定，每层蛋白质不太一样），上样的时候注意吸中间层，离心后不需要放在4℃，否则会结冰。
上样，蛋白marker 4uL，样本视情况而定，空出来的泳道加loading。 注：用1.5mm的板子制胶。
5、配制凝胶
下层胶溶液(2×)+下层胶缓冲液(2×)
同时跑2块板的用量：9 mL溶液+9mL缓冲液+180μL促凝剂
雅酶PAGE凝胶快速制备试剂盒
上层胶溶液(2×)+彩色上层胶缓冲液(2×)
同时跑2块板的用量：2.5mL溶液+2.5mL缓冲液+50μL促凝剂
雅酶PAGE凝胶快速制备试剂盒
洗板子：用肥皂搓一下玻璃板，用水冲干净，再用dd水冲一遍，放在架子上，要用的面不要碰到架子，放进烘箱烘干。
烘干间隙，配置下层胶溶液+下层胶缓冲液（如上表），先不加促凝剂。
将长短玻璃板底端对齐，短板朝内夹在板架上，确定底边对齐，防止漏胶；
向上层胶溶液内加入促凝剂。胶摇匀后立刻灌胶，用枪头缓慢从左至右将分离胶注入玻璃板。
加上胶后加乙醇封胶，移动缓慢加乙醇，赶走气泡。
等待胶凝，大约15min，等待结束前配置浓缩胶即上层胶溶液。
等待的间隙可以配置1L电泳液（粉末（含SDS）倒入瓶子，加1L dd水）、1L转膜液（粉末倒入瓶中+ddH2O 1L）。
倒掉乙醇，用滤纸小心吸一下，注意不要碰到胶；或者在吸水纸上倒置制胶器沥干水。
胶摇匀后将上层胶注入玻璃板，加至稍微溢出，立即插入梳子（提前洗净擦干），注意不要有气泡，等待15min胶凝。
等待的间隙可以95-100℃金属浴加热蛋白样品5min，再10000rpm离心5min
附：试剂盒说明书
【预制胶】
预制胶可以省去配胶流程，但其电泳体系略有不同
下以ACE预制胶为例，介绍注意事项
预制胶注意事项:
1.胶板粉色胶条撕掉
2.电泳槽内槽胶条翻面，平面朝外
3.检查内槽有无漏液：内槽加满，观察两分钟有没有液体流出
4.12孔的推荐上样量30ul以下，15孔的推荐上样量20u以下，每孔总蛋白推荐上样量不超过30μg，纯蛋白推荐不超过100ng
5.内槽电泳液每次用完倒掉，下次用新的电泳液，外槽可重复利用3次，配置出来后5天内使用完，用不完冷藏保存不超过一周
6.推荐电压160v，40分钟，最高不超过180v，可以低电压，只是影响电泳时间
7.保证上样体积相同，浓度一致，可以用 loading去稀释
8.每次上样前样品都需先做上样前处理，超声30s，95-100℃煮5-10min，然后12000转高速离心10min后取上清上样
6、丙烯酰胺凝胶电泳
配制电泳液1L（粉末（含SDS）倒入瓶子，加1L dd水），转膜液1L （粉末倒入瓶中+ddH2O 800mL+甲醇200mL；若蛋白分子量较小，可适当增加转膜液中甲醇体积；大分子蛋白反之）。
短板上端卡在电极板的绿色卡口处，红对红，黑对黑放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液，先从电极板中间加入，倒满后再倒入槽中。外侧电泳液没过架子底部即可，观察是否漏液，如果漏液就取出重新加，不漏液就垂直向上拔出梳子加样。（预留蛋白Marker的孔位，注意加样顺序与方向）。
取出蛋白样本，每样本孔视情况加样（9-10uL，marker加4μL，剩余孔加6μL 1X loading buffer【5X的SDSpage+RIPA稀释】）。
电泳，150V电压50min。
7、电转膜仪转膜
Western Blot常用PVDF（聚偏二氟乙烯）膜，具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。转膜（实验室常用湿转，稳定性较好，实验准备转膜套装（转膜夹子、海绵）、甲醇、滤纸、PVDF膜（使用前甲醇浸泡至透明，甲醇可回收））。 配置好转膜液；
剪一张比胶更大一点的膜（大约8.5cm*6cm）；
转膜液提前30min于-80℃或-20℃预冷；
提前准备好碎冰（电转膜仪放在盆子里，周围用冰埋住）；
在盘内倒入转膜液，放入转膜夹，液面高度齐平滤纸；
用镊子将PVDF膜在甲醇中浸泡30s激活，取出PVDF膜放入转膜液洗一下（PVDF膜保持湿润，如果变干则需要重新激活；金属镊子不能碰到可能和胶接触的部分）。
剥胶，将玻璃板撬掉，撬的时候动作要轻，玻璃板撬松动后，将上层浓缩胶轻轻刮去，要避免把下层分离胶刮破（若分离胶太干可以用水冲洗湿润），可根据上样顺序将胶切角，方便后续辨认。
转膜，将转膜夹子放在盛有转膜液的托盘中，转膜夹透明面朝下(正极)，放上海绵→2-3层滤纸→膜→胶→滤纸→海绵，最后黑色面朝上（注意膜和胶的放入顺序）；放入胶后用刮板轻轻赶走气泡，注意不能挤压牵拉到胶。夹好转膜夹（转膜的夹子一定要适当紧一点，夹起的过程中不要直接施力于夹子中间，以防挤压到胶），放入转膜槽（注意正负极，黑对黑），倒入转膜液没过转膜夹，槽内放置冰盒降温（冰盒可提前放入-80℃预冷），加持恒流电压恒流300mA ，60min（分子量大的蛋白可适当延长转膜时间）。
转膜过程会产生大量的热，整个转膜装置需要冰浴。操作结束后将玻璃板洗干净，避免胶粘附在玻璃板上。
等待间隙可以配置TBST和脱脂奶粉。
8、封闭
配1L 0.05%TBST（1L TBS加500uL Tween-20；若蛋白分子量较小或显影后背景较黑，可适当提高吐温含量至1%）。配5%脱脂奶粉（2.5g奶粉+50mL TBST），37℃摇床最快转速（200转）摇1h。
将TBST倒到塑料盒中，浸没PVDF膜，摇床50转摇10分钟，洗一次。倒掉TBST，倒入脱脂奶粉，脱脂奶粉摇床50转封闭30min-1h（若显影后背景较黑可适当延长封闭时间）。
9、一抗孵育
取出封闭塑料盒，倒掉脱脂牛奶，用TBST洗PVDF膜，摇床100转10分钟，重复三次。
用刀片切割PVDF膜，不同大小的蛋白切割到不同条带上方便孵育（可以在左上角剪一个角便于分清正反面），切割过程中PVDF膜不能干，切好的PVDF膜放入塑料盒中，用一抗稀释液按1：1000比例配抗体【具体参照抗体说明书】，摇床慢速（保证液体摇晃即可）摇晃孵育6-8小时（过夜）（抗体放冰盒否则短时间内会失效，用完抗体立马收到-20℃冰箱）。
孵育结束后抗体回收到离心管中，4℃冰箱保存，用TBST洗膜，摇床100转摇10分钟，重复3-4遍。
用TBST或者WB专用二抗稀释液配二抗（goat anti-rabbit二抗分装后置于4℃，抗体：TBST=1：5000/1：10000），洗掉一抗后，每张膜加5mL二抗，摇床50转孵育1小时。
孵育结束后弃掉二抗（二抗不回收），用TBST洗膜，摇床100转5分钟，洗3-4遍（若显影后背景较黑可适当延长洗膜次数或时间）。
10、显影
配好显影液（A液：B液=1：1），用纸沥干TBST，将膜放入显影仪后滴上显影液，启动程序；注意显影液需现配现用，使用过程中注意避光。
记录曝光时长（30-300sec）、原始膜的照片
整膜的要求与解决方案
方法一：抗体剥脱
适用于蛋白分子量相距较近，或孵育磷酸化蛋白的情况
方法二：抗体同时敷育
适用于蛋白分子量相距较远的情况
方法三：裁剪拼接
适用于多种情况，尤其是Co-IP，泛素化IP。
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