小鼠肿瘤单细胞悬液制备
By J.Y. & K.Y
Last updated
By J.Y. & K.Y
Last updated
一、取材
1、肿瘤免疫细胞
(1) 将小鼠肿瘤小心剥离，放入PBS浸泡，沥干水后放入EP管，用剪刀尽量将肿瘤组织剪碎成肉糜（冰上操作）。
(2) 配制消化液（2.35mL DMEM+100μL酶D+10μL酶R+12.5μL酶A）【美天旎肿瘤分选KIThttps://www.miltenyibiotec.com/CN-en/products/tumor-dissociation-kit-mouse.html#130-096-730】，吸取消化液2.5mL至50mL离心管中，用巴氏管吸取消化液至EP管中与肿瘤组织混匀，将EP管中肿瘤组织转移至50mL离心管中与消化液混合。
(3) 37℃恒温摇床180rpm消化60min。
(4) 取出50mL离心管，将消化液用100μm滤网过滤至另一50mL离心管中，用PBS涮洗离心管，加PBS至35mL，离心。
(5) 弃上清，加PBS至4mL重悬，吹打混匀。
(6) 配制70%和40%的percoll，在15mL离心管中先加4mL70%的percoll，巴氏管缓慢点4mL 40%的percoll（可以用DMEM配制），再用巴氏管点4mL肿瘤细胞。
Percoll配制方法：100%percoll：9份percoll原液+1份10×PBS；之后再用100%percoll配制40/70%的percoll。
(7) 上机，密度梯度离心，升降速0，2000rpm 30min。
(8) 离心后用吸引器将上层肿瘤细胞吸走，留下40%/70%percoll及两层中间的免疫细胞共6mL。
(9) 用巴氏管吸取云雾层免疫细胞至50mL离心管中，加大量PBS，颠倒摇晃混匀（目的是稀释混匀percoll，便于离心），离心4℃，700g，7min。
(10) 弃上清，加1mL PBS/DMEM重悬，吹打混匀细胞。
2、外周血免疫细胞
(1) 摘小鼠眼球取血至抗凝管中，加PBS至1mL。
(2) 在流式管中加入1mL ficoll，用移液枪沿流式管管壁小心加入1mL血浆。
(3) 密度梯度离心，2000rpm,30min。
(4) 吸取中间云雾层至另一流式管中，加PBS至10-15mL，混匀。
(5) 离心，弃上清。
(6) 如果吸取红细胞过多，加入ACK破红，裂解3-5min（破红视情况而定，若几乎没有红细胞不应裂红，裂解液对细胞有一定损伤）。
(7) 加入PBS离心，弃上清。重悬细胞（PBS或者DMEM均可）。
二、表染
1、取细胞悬液（将细胞悬液均分至表染、胞染、核染三个panel中，表染可以稍微少一些，参考：150μL）至流式管中，加2mL PBS洗净培养基。
2、离心500g 5min，倒掉PBS，在纸上沥干液体，刮架子重悬细胞。
3、加FC block 4℃避光孵育10min，配体系的时候可以多配一点PBS（如六个管加160μLPBS和3μL FC Block）。
4、加2mL PBS洗去FC block，4℃离心500g/5min。沥干液体，重悬细胞。（FC Block不洗掉也可以）。
5、挑出单染管，每管吸取一定量液体（视情况而定）混合分配至各单染管，单染管加单个抗体，其他管加混合抗体。
6、配表染抗体，每管加50/25μL体系，避光4℃孵育30min。
7、取出流式管，加2mL PBS，离心500g 5min，弃上清（不需要沥干水珠），刮架子重悬。
8、加100-200μL的PBS（可不加），上机。如果不能立刻上机，加入100-200μL IC fixation固定。
最后加入的液体量视细胞数量而定，一般是100-200μL。
三、核染
1、取细胞悬液（液体量见上）至流式管中，加2mL PBS。
2、离心500g 5min，倒掉PBS，沥干液体，刮架子重悬细胞。
3、加FC block 4℃避光孵育10min。
4、加2mL PBS洗去FC block，4℃离心500g/5min。
5、挑出单染管，每管吸取一定量液体（视情况而定）混合分配至各单染管，单染管加单个抗体，其他管加混合抗体。
6、配表染抗体，每管加50/25μL体系，避光4℃孵育30min。
7、加2mL PBS，4℃ 离心 500g/5min，倒掉PBS，沥干水珠。
8、配制固定液，比例3：1，每管加1mL。室温固定40min。
9、用破膜液洗去固定液（破膜液用dd水稀释10倍），加入流式管，每管2ml。
10、流式管离心，500g 5min 4℃，离心后把破膜液倒入废液缸，刮架子混匀。洗两次，正式染色前把液体沥干。
11、配核染抗体：50/25μL体系，用破膜液配制，室温避光染色40min。
12、染色后加2mL破膜液，离心500g/5min,4℃，沥干液体。该步骤重复一次。
13、洗完后加PBS/破膜液，上机。
四、胞染
1、准备48孔板和500*cooktail。
2、将免疫细胞加入48孔板，每孔100/150μL。
3、配制cooktail：每孔总量300μL，500*cooktail即每孔加0.6μL，用TCM补足300μL。
4、刺激4.5小时。
5、取细胞悬液至流式管中，加2mL PBS洗净培养基。
6、离心500g 5min，倒掉PBS，沥干液体，刮架子重悬细胞。
7、加FC block 4℃避光孵育10min。加2mL PBS洗去FC block，4℃离心500g/5min。
8、挑出单染管，每管吸取一定量液体混合分配至各单染管，单染管加单个抗体，其他管加混合抗体。
9、配表染抗体，每管加50/25μL体系，避光4℃孵育30min。
10、取出流式管，加2mL PBS，离心500g 5min，弃上清（不需要沥干水珠），刮架子重悬。
以上为表染步骤
11、加入100μL胞内固定液（IC fixation）来固定细胞，混匀样本，室温避光孵育1h，4℃下可以存放过夜。
12、加2mL1×破膜液，4℃离心500g 5min，弃上清。该步骤重复一次。
13、配制胞染抗体：用破膜液配制，避光保存，50μL体系。
14、加100μL 1X破膜液重悬细胞，并加入流式胞内抗体，室温避光孵育20-60分钟。
15、加入2mL 1X破膜液，在室温下500g/5min，弃上清。该步骤重复一次。
16、加PBS/破膜液重悬细胞，上机。
L/D加0.2μl，BV加0.25μL，其他加0.5μL。
参考文献：Tumor dissociation of highly viable cell suspensions for single-cell omic analyses in mouse models of breast cancer
准备试剂；
将培养箱和水浴开至37℃，离心机4℃预冷；
准备手术器械：提前洗净的剪刀、镊子；
15毫升、50毫升、1.5毫升离心管若干，巴式吸管若干；
对每个样本，准备一个15 mL 离心管，每管加入4.5 mL 5%FBS/DMEM高糖培养基；
解冻胶原酶-透明质酸酶（10×）、DNase（1mg/mL），倒取100mL DPBS，置于冰上。
配置胶原酶-透明质酸酶（10×）
胶原酶贮存液：取出Collagenase I 粉末(Sigma-Aldrich, v900891) ，根据批次查询，Lot #WXBF1554V为285U/mg；先用含有钙镁的HBSS缓冲液溶解为浓度100mg/mL贮存液。
50mL（10×）：50mL DMEM中溶解 150,000 U 胶原酶I（Sigma V900891），50,000 U透明质酸酶（Sigma H3506-1G）；
10mL（10×）：10mL DMEM中溶解30000U （105 mg） 胶原酶I（约1mL的100mg/mL贮存液）和10000U 透明质酸酶（已稀释成10mg/mL贮存液，约需1-2mL）；
在1.5 mL EP管中等分，在20℃下储存直至使用；
DNase Ⅰ (1mg/mL）
将100 mg DNase溶解在100 mL DPBS中；
在1.5 mL EP管中等分，在20℃下储存直至使用；
1 × TEG (可用商业化0.25% Trypsin-EDTA代替)
将10 mL 2.5%胰蛋白酶（Gibco 15090-046）稀释在90 mL DPBS中，制备0.25%胰酶储备液；
将40 mg EGTA（Sigma E3889-25G）和10 mg聚乙烯醇（Sigma P8136250G）溶解在0.25%胰蛋白酶中（可能需要vortex）；
在1.5 mL EP管中等分，在20℃下储存直至使用；
Dispase II溶液（现用现配）
将25mg Dispase II重悬于5mL DPBS中（5mg/mL），充分混合。将溶液保持在20℃-22℃；
红细胞裂解液（可用商品化ACK裂解液代替）
将4.15克氯化铵（Sigma A9434-500G）溶解在50mL 0.1M Tris-HCl和450mL ddH2O中；
将pH值调节至7.5+/-0.2，4℃保存；
商品化的ACK裂解液：配方一般是 8.29g/L NH₄Cl、1.0g/L KHCO₃和 0.0372g/L EDTA，pH 值为 7.2 - 7.4
5% FBS/ DMEM High Glucose
将25 mL FBS稀释在475 mL 高糖DMEM中；
在4℃下可储存1个月；
2% FBS/DPBS
在490 mL DPBS中稀释10 mL FBS；
在4℃下可储存1个月；
分离肿瘤，用PBS润洗，用剪刀将组织剪碎为3-5mm的肉糜匀浆（越碎越好），加到4.5 mL 5%FBS的DMEM高糖培养基中；
将500 μL胶原酶-透明质酸酶（10×）加入到含有样品和4.5 mL 5%FBS/DMEM的15 mL 离心管；
在培养箱中，以200 rpm的速度在37℃下与1×胶原酶-透明质酸酶一起振荡30分钟；孵育15分钟时，为确保组织充分再悬浮，用巴式吸管上下移液至少10次，破坏组织；尽管仍可观察到肉眼可见的肿瘤块，但浑浊的非半透明介质表明组织已被适当消化；
流式提前开机质控；
加入10mL冷DPBS来中和消化从而清洗样品，300g 4℃离心5分钟，弃上清；
用100μL DNase溶液重悬沉淀；
加入750 μL 胰酶，在37℃水浴中上下移液1分钟；
用2%FBS/DPBS补至15 mL，300g 4℃离心5分钟，弃上清；
向每管中加入1.25 mL Dispase溶液，在37℃的水浴中孵育5分钟，300g 4℃离心5分钟，弃上清；
将沉淀重悬于50 μL DNase溶液和450 μL 2%FBS/DPBS；
加入2mL红细胞裂解液，重悬，在37℃水浴下孵育2分钟；
用2%FBS/DPBS补至15 mL中和，300g 4℃离心5分钟，弃上清（此时沉淀应为白色）；
【这一步开始将样品置于冰上！】
将沉淀重新悬浮于5-10mL冷的2%FBS/DPBS中，并使用70mm滤器过滤到50mL离心管中；
台盼蓝计数细胞，制备密度在1 × 10^6 - 1 × 10^7/mL的单细胞悬浮液；
流式分选（全部步骤在4℃进行）；
确保流式提前开机质控！
含有单细胞悬液的50mL离心管300g 4℃离心5分钟，用100-200μL左右的2% FBS/DPBS重悬，转移至15mL管中；
每管加0.5 μL Human/Mouse Fc block 4℃避光孵育10min；
300g 4℃离心5分钟；
将颗粒重悬于最终体积为100-200 μL的2% FBS/DPBS溶液中，每管加入抗人/鼠CD45流式抗体（0.5μL）和live&dead（0.5μL，APC通道）；
冰上孵育30min；或室温15分钟；
在30分钟的孵育时间内，在15mL离心管内加入4-5mL DMEM完全培养基，作为收集管（要覆盖底部和侧壁）；
抗体孵育结束后，加入1mL 2%FBS/DPBS来洗涤样品；
300g 4℃离心5分钟，弃上清，将颗粒重悬浮于1 mL 2%FBS/DPBS中；
将样品避光放在冰上，直至FACS分选；
将流式分选粒径设为100μm；
通过在FSC-A和SSC-A点图中选择细胞室来设置门控策略。使用FSC-A和FSC-H排除双细胞，选择活死的阴性部分，并对CD45和GFP/mCherry的阳性细胞进行门控；
分选L/D-GFP+的肿瘤细胞，用于后续提蛋白、提RNA以及体外培养。
备注：NSG鼠分选人肿瘤细胞可以省略FcBlock和CD45抗体染色步骤，只需要染活死染料。
参考文献：Metastatic recurrence in colorectal cancer arises from residual EMP1+ cells
目的：分离没有明显转移灶的肿瘤拨散细胞。
实验步骤：
1、分离肝脏，PBS润洗，用剪刀将肝脏彻底剪碎；
2、将组织用200 U/ml的collagenase IV (Sigma-Aldrich, v900893) （根据批次查询，Lot #WXBF3069V为205U/mg，约为1mg/mL；贮存浓度为100mg/mL含有钙镁的HBSS缓冲液） 37℃消化30分钟，用100μm滤网过滤（仍会有一些肿瘤细胞残留在滤网上）；
3、进一步消化：把滤网置于6孔板上，用含有200 U/mL collagenase IV, 200 μg/mL dispase II (Sigma-Aldrich, D4693), 40 μg/mL DNase I (Sigma-Aldrich, 10104159001) 和 13 μM rock inhibitor (MedChem Express, HY-27632，DMSO溶解)的HBSS溶液将其浸没，37℃再消化30min；
4、将滤过液用PBS洗涤、ACK或氯化铵破红、抗体染色；
5、分选GFP+CD45−的活细胞，即为肿瘤细胞。
