# 小鼠肿瘤单细胞悬液制备

## （一）普通皮下瘤

### 一、前期准备

#### 1、消化酶配置：

美天旎肿瘤分选KIT（<https://www.miltenyibiotec.com/CN-en/products/tumor-dissociation-kit-mouse.html#130-096-730>

* Enzyme D：试剂盒内有2管冻干粉，每管溶于3mL DMEM或RPMI 1640，按1mL分装冻于-20℃；
* Enzyme R：试剂盒内有1管冻干粉，用2.7mL DMEM或RPMI 1640溶解，200μL分装冻于-20℃；
* Enzyme A：试剂盒内有1管冻干粉，用 1mL <mark style="color:red;">Buffer A</mark>重悬，不要vortex，100μL分装冻于-20℃；
* 如细胞有培养需求，酶D应该过滤除菌；

#### 2、试剂及耗材准备

* 手术器械：眼科剪（锋利的）、镊子若干
* 溶液：1 × PBS、DMEM（无添加）、ACK红细胞裂解液、Percoll、Ficoll、ddH2O；
* 试剂：流式抗体（包括活死染料、FcBlock）、Cocktail（Invitrogen，Cell Stimulation Cocktail plus
  \
  protein transport inhibitors）、IC fixation（Invitrogen，Intracellular (IC) Fixation Buffer）、破膜缓冲液（Invitrogen eBioscience，Permeabilization Buffer (10X)）、破核固定液（Invitrogen，Fixation/Permeabilization Concentrate + Fixation/Permeabilization Diluent）、RPMI 1640完全培养基；
* 耗材：15/50mL离心管（可以提前1天标记好样本），1.5 mL EP管，抗凝采血管，巴式吸管，100μm滤网，流式管及流式管架；
* 其他：碎冰、冰盒；

### 二、取材

#### 1、肿瘤免疫细胞

(1)     将小鼠肿瘤小心剥离，去除脂肪、纤维化、坏死灶部位，放入PBS浸泡，沥干水后放入EP管，<mark style="color:red;">在冰上</mark>用眼科剪尽量将肿瘤组织剪碎成肉糜（2-4mm）。

(2)     配制消化液（<mark style="color:red;">2.35mL DMEM+100μL酶D+10μL酶R+12.5μL酶A</mark>），吸取消化液2.5mL至50mL离心管中，用巴氏吸管吸取消化液至EP管中与肿瘤组织混匀，将EP管中肿瘤组织转移至50mL离心管中与消化液混合。

【 注意 】：目的细胞如为肿瘤细胞，Enzyme R可用<mark style="color:red;">50μL/管</mark>；目的细胞如为浸润免疫细胞，应减至<mark style="color:red;">10μL/管</mark>

<figure><img src="/files/5sMRAQVu2JJCXqX9AfGW" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

(3)     37℃恒温摇床（或使用 gentleMACS Dissociator）180rpm消化30-60min（每15分钟观察消化状态）。消化期间可以<mark style="color:red;">标记流式管</mark>。

(4)     取出50mL离心管，将消化液用100μm滤网过滤至另一50mL离心管中，用PBS涮洗离心管，加PBS至35mL，离心。

(5)     弃上清，加PBS至4mL重悬，吹打混匀（如果红细胞较多可以用ACK裂解液破红再离心）。

<mark style="color:red;">【步骤6-10为可选】</mark>

(6)    配制70%和40%的<mark style="color:red;">percoll</mark>；在15mL离心管中先加入4mL 70%的percoll，再倾斜离心管，用巴氏吸管沿壁缓慢添加4mL 40%的percoll（可以用DMEM配制），最后用巴氏吸管沿壁缓慢添加4mL肿瘤细胞悬液。

{% hint style="info" %}
Percoll配制方法：

先配置100%percoll：9份 percoll原液 + 1份 <mark style="color:red;">10×PBS</mark>；

再用100%percoll 配制40%及70%的percoll；
{% endhint %}

(7)     上机，密度梯度离心，<mark style="color:red;">升降速设置为 0</mark>，2000rpm 离心 30min。

(8)     离心后，用移液器将上层肿瘤细胞吸走，留下40%/70%percoll及两层中间的免疫细胞共6mL。

(9)     用巴氏管吸取云雾层免疫细胞至50mL离心管中，加大量PBS，颠倒摇晃混匀（目的是稀释混匀percoll，便于离心），离心4℃，700g，7min。

(10)   弃上清，加1mL PBS/DMEM重悬，吹打混匀细胞。

#### 2、外周血单个核细胞

(1)     摘小鼠眼球取血至抗凝管中，使用PBS 1：1 稀释样本（或添加至1mL）。

(2)     在流式管中加入与稀释前全血样本相同体积的Ficoll（1mlL），倾斜流式管，用移液枪<mark style="color:red;">沿壁缓慢</mark>小心加入1mL血浆（注意不要让两层混合）。

(3)     密度梯度离心，<mark style="color:red;">升降速设置为 0</mark>，2000rpm, 30min。

(4)     用巴式吸管小心吸取PBS和Ficoll层交界处<mark style="color:red;">云雾状</mark>的单核细胞层至另一流式管中，加PBS至10-15mL，混匀。

(5)     离心，弃上清。

(6)     如果吸取红细胞过多，加入3-5mL ACK破红，裂解3-5min（破红视情况而定，若几乎没有红细胞不应裂红，裂解液对细胞有一定损伤）。

(7)     加入PBS离心，弃上清。重悬细胞（PBS或者DMEM均可）。

### 三、表染

外周血样本与肿瘤内浸润免疫细胞样本可以同时进行染色。

1、取细胞悬液（将细胞悬液均分至<mark style="color:red;">表染、胞染、核染等</mark>panel中，表染可以稍微少一些，参考：150μL）至流式管中，加2mL PBS洗净培养基。

2、离心500g 5min，倒掉PBS，在纸上沥干液体，刮架子重悬细胞。

3、加<mark style="color:red;">Fc Block</mark> 4℃避光孵育10min，配体系的时候可以多配一点PBS（如六个管加160μLPBS和3μL FC Block）。

{% hint style="info" %}
mouse：每50uL 细胞标本加入0.5μL 抗小鼠CD16/ CD32抗体；

human：每50uL 细胞标本加入0.5-1 μL人Fc 受体结合抑制剂；
{% endhint %}

4、加2mL PBS洗去FC block，4℃离心500g/5min。沥干液体，重悬细胞。（FC Block不洗掉也可以）。

5、挑出<mark style="color:red;">空白管</mark>、<mark style="color:red;">单染管</mark>：

* 空白管（Blank管）：每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至空白管；
* 单染管：每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至各单染管，单染管加单个抗体，其他管加混合抗体；

6、用PBS配置表染抗体，L/D每样本管加0.2μl，BV加0.25μL，其他抗体加0.5μL；每个样本管加50/25μL抗体体系，单染管单独加。<mark style="color:red;">避光4℃孵育30min</mark>。

7、取出流式管，加2mL PBS，离心500g 5min，弃上清（不需要沥干水珠），刮架子重悬。

8、加100-200μL的PBS（可不加），上机。如果不能立刻上机，加入100-200μL <mark style="color:red;">IC fixation</mark>固定（最后加入的液体量视细胞数量而定，一般是100-200μL）。

### 四、核染

1、取细胞悬液（液体量见上）至流式管中，加2mL PBS。

2、离心500g 5min，倒掉PBS，沥干液体，刮流式管架重悬细胞。

3、加<mark style="color:red;">FC Block</mark> 4℃避光孵育10min。

4、加2mL PBS洗去Fc Block，4℃离心500g/5min。

5、挑出<mark style="color:red;">空白管</mark>、<mark style="color:red;">单染管</mark>：

* 空白管（Blank管）：每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至空白管，后续同样需要进行破核；
* 单染管：每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至各单染管，单染管加单个抗体（核染抗体的单染管先不加抗体，破核固定后再加抗体）；

每管吸取一定量液体（视情况而定）混合分配至各单染管，单染管加单个抗体，其他管加混合抗体。

6、配<mark style="color:red;">表染抗体</mark>，每管加50/25μL体系，避光4℃孵育30min；单染管单独加。

7、加2mL PBS，4℃ 离心 500g/5min，倒掉PBS，沥干水珠。

（以上同表染步骤）

8、每个样本管加入<mark style="color:red;">1mL</mark>新鲜配制的<mark style="color:red;">破核固定液</mark>。室温固定<mark style="color:red;">40min</mark>（小鼠细胞样本可在2-8°C下避光孵育最多18小时）。

{% hint style="info" %}
破核固定液配置方法：Fix/Perm Concentrate小黑瓶：Fix Perm Diluent大白瓶 = 1：3

1×破膜液（1×Perm）配置方法：ddH2O：10X Perm = 9：1
{% endhint %}

9、每管加入2mL <mark style="color:red;">1×破膜液</mark>，洗去固定液， 4℃ 500g 离心5min。

10、弃上清，刮流式管架混匀。<mark style="color:red;">重复</mark>洗一次。正式染色前把液体沥干，最终体积调至约100 μL。

11、设置：

* FMO：从每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至FMO管，该管后续不添加Foxp3抗体。

12、用<mark style="color:red;">1×破膜液</mark>（1×Perm）配置<mark style="color:red;">核染抗体</mark>（50/25μL体系）。

13、除FMO管和空白管外，其余样本管添加核染抗体，<mark style="color:red;">室温避光染色40min</mark>。

14、染色后加<mark style="color:red;">2mL 1×破膜液</mark>，500g 4℃ 离心5min,，沥干液体。该步骤<mark style="color:red;">重复</mark>一次。

15、洗完后加PBS / 1×破膜液，上机。

### 五、胞染

1、向各样本的细胞悬液加入2mL PBS。500g 离心5min，倒掉PBS，在纸上沥干液体，刮架子重悬细胞。

2、上述样本离心期间，配置含有准备Cocktail的T细胞培养基：

* 取24/48孔板并<mark style="color:red;">标记</mark>样本孔，取500 ×Cocktail（保存于-20℃）置于冰上；
* 根据需要的孔数（24孔板每孔500μL培养体系，48孔板每孔100-150μL，细胞浓度在3×10^6个细胞/mL左右），取一定量<mark style="color:red;">RPMI 1640完全培养基</mark>，加入<mark style="color:red;">Cocktail（500×）</mark>

3、将流式管内细胞沉淀用上述培养基重悬，转移至24/48孔板。

4、静置于37℃培养箱，刺激<mark style="color:red;">4-5小时</mark>。

5、取细胞悬液至流式管中，加2mL PBS洗净培养基。

6、离心500g 5min，倒掉PBS，沥干液体，刮架子重悬细胞。

7、加Fc block 4℃避光孵育10min。加2mL PBS洗去FC block，4℃离心500g/5min。

8、挑出<mark style="color:red;">空白管</mark>、<mark style="color:red;">单染管</mark>：

* 空白管（Blank管）：每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至空白管，后续同样需要进行破膜；
* 单染管：每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至各单染管，单染管加单个抗体（胞染抗体的单染管先不加抗体，破膜固定后再加抗体）；

9、配表染抗体，每管加50/25μL体系，避光4℃孵育30min。

10、取出流式管，加2mL PBS，离心500g 5min，弃上清（不需要沥干水珠），刮架子重悬。

（以上同表染步骤）

11、加入100μL <mark style="color:red;">胞内固定液</mark>（<mark style="color:red;">IC fixation</mark>）来固定细胞，混匀样本，室温避光孵育1h，4℃下可以存放过夜。

12、加2mL 1×破膜液，4℃离心500g 5min，弃上清。该步骤<mark style="color:red;">重复一次</mark>。加100μL 1×破膜液重悬细胞。

13、设置<mark style="color:red;">FMO管</mark>：

* FMO：从每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至3个FMO管，每管单独缺少GZMB/IFNG/Peforin抗体。

14、配制胞染抗体：用<mark style="color:red;">1X破膜液</mark>配制，避光保存，50μL体系。

15、除空白管外，加入流式胞内抗体（FMO管少加1种抗体），室温避光孵育20-60分钟。

16、加入<mark style="color:red;">2mL 1×破膜液</mark>，在室温下500g/5min，弃上清。该步骤<mark style="color:red;">重复一次</mark>。

17、加PBS/破膜液重悬细胞，上机。

<figure><img src="/files/2TMx7DeyrTZIm18AFYAd" alt=""><figcaption><p>示例panel</p></figcaption></figure>

<figure><img src="/files/9VDmFqCZ9JHp7UAdqANQ" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

## （二）原发/转移肿瘤消化

* 参考文献：Tumor dissociation of highly viable cell suspensions for single-cell omic analyses in mouse models of breast cancer

<figure><img src="/files/HYxOnKQ5yTILvtnN7LU2" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

### 前期准备

* <mark style="color:red;">提前清点试剂</mark>；
* 将培养箱和水浴开至37℃，离心机4℃预冷；
* 准备手术器械：提前洗净的剪刀、镊子，紫外辐照30min；
* 准备耗材：备15毫升、50毫升、1.5毫升离心管若干，巴式吸管若干；
* 配置流式鞘液：10×PBS+ddH2O稀释；
* 准备流式抗体：如L/D 抗体，CD45抗体；
* 准备0.25%胰酶、ACK裂红液、Dispase II粉末，解冻胶原酶-透明质酸酶（10×）、DNase（1mg/mL），倒取100mL DPBS，置于冰上。
* 对每个样本，准备一个15 mL 离心管，每管加入4.5 mL 5%FBS/DMEM高糖培养基；

### 配置贮存液

* 配置胶原酶-透明质酸酶（10×）
  * 配置胶原酶贮存液：取出<mark style="color:red;">Collagenase I</mark> 粉末(Sigma-Aldrich, v900891) ，根据批次查询，Lot #WXBF1554V为285U/mg；先用含有钙镁的HBSS缓冲液溶解为浓度<mark style="color:red;">100mg/mL贮存液</mark>。
  * 配置胶原酶-透明质酸酶混合液（10×）
    * 如配置50mL（10×）：50mL DMEM中溶解 150,000 U 胶原酶I（Sigma V900891），50,000 U透明质酸酶（Sigma H3506-1G）；
    * 如配置10mL（10×）：10mL DMEM中溶解30000U （105 mg） 胶原酶I（约1mL的100mg/mL贮存液）和10000U 透明质酸酶（已稀释成10mg/mL贮存液，约需1-2mL）；
  * 最后将10×混合液在1.5 mL EP管中等分，在20℃下储存直至使用；
* DNase Ⅰ (1mg/mL）
  * 将100 mg DNase溶解在100 mL DPBS中；
  * 在1.5 mL EP管中等分，在20℃下储存直至使用；
* 1 × TEG (可用商业化<mark style="color:red;">0.25% Trypsin-EDTA</mark>代替)
  * 将10 mL 2.5%胰蛋白酶（Gibco 15090-046）稀释在90 mL DPBS中，制备0.25%胰酶储备液；
  * 将40 mg EGTA（Sigma E3889-25G）和10 mg聚乙烯醇（Sigma P8136250G）溶解在0.25%胰蛋白酶中（可能需要vortex）；
  * 在1.5 mL EP管中等分，在20℃下储存直至使用；
* Dispase II溶液（现用现配）
  * 将25mg Dispase II重悬于5mL DPBS中（5mg/mL），充分混合。将溶液保持在20℃-22℃；
* 红细胞裂解液（可用<mark style="color:red;">商品化ACK裂解液</mark>代替）
  * 将4.15克氯化铵（Sigma A9434-500G）溶解在50mL 0.1M Tris-HCl和450mL ddH2O中；
  * 将pH值调节至7.5+/-0.2，4℃保存；
  * 商品化的ACK裂解液：配方一般是 8.29g/L NH₄Cl、1.0g/L KHCO₃和 0.0372g/L EDTA，pH 值为 7.2 - 7.4
* 5% FBS/ DMEM High Glucose
  * 将25 mL FBS稀释在475 mL 高糖DMEM中；
  * 在4℃下可储存1个月；
* 2% FBS/DPBS
  * 在490 mL DPBS中稀释10 mL FBS；
  * 在4℃下可储存1个月；

### 肿瘤获取

* 分离肿瘤，用DPBS（如有分离培养需求可添加<mark style="color:red;">1%双抗</mark>）润洗3次，用剪刀将组织剪碎为3-5mm的肉糜匀浆（越碎越好），加到4.5 mL 5%FBS的DMEM高糖培养基中；
* 将500 μL<mark style="color:red;">胶原酶-透明质酸酶（10×）</mark>加入到含有样品和4.5 mL 5%FBS/DMEM的15 mL 离心管；
* 在培养箱中，以200 rpm的速度在37℃下与1×胶原酶-透明质酸酶一起振荡<mark style="color:red;">30分钟（可视情况延长）</mark>；孵育15分钟时，为确保组织充分再悬浮，用巴式吸管上下移液至少10次，破坏组织；尽管仍可观察到肉眼可见的肿瘤块，但浑浊的非半透明介质表明组织已被适当消化；
* 流式提前开机质控；
* 加入10mL<mark style="color:red;">冷DPBS</mark>来中和消化从而清洗样品，300g 4℃离心5分钟，弃上清；
* 用100μL <mark style="color:red;">DNase溶液</mark>重悬沉淀；
* 加入750 μL <mark style="color:red;">胰酶</mark>，在37℃水浴中上下移液1分钟；
* 用<mark style="color:red;">2%FBS/DPBS</mark>补至15 mL，300g 4℃离心5分钟，弃上清；
* 向每管中加入1.25 mL <mark style="color:red;">Dispase溶液</mark>，在37℃的水浴中孵育5分钟，300g 4℃离心5分钟，弃上清；
* 将沉淀重悬于50 μL <mark style="color:red;">DNase溶液</mark>和450 μL 2%FBS/DPBS；
* 加入2mL<mark style="color:red;">红细胞裂解液</mark>，重悬，在37℃水浴下孵育2分钟；
* 用2%FBS/DPBS补至15 mL中和，300g 4℃离心5分钟，弃上清（此时沉淀应为白色）；
* 【<mark style="color:red;">这一步开始将样品置于冰上！</mark>】
* 将沉淀重新悬浮于5-10mL冷的<mark style="color:red;">2%FBS/DPBS</mark>中，并使用70mm滤器过滤到50mL离心管中；
* 台盼蓝计数细胞，制备密度在1 × 10^6 - 1 × 10^7/mL的单细胞悬浮液；
* 流式分选（<mark style="color:red;">全部步骤在4℃进行</mark>）；
  * 确保流式提前开机质控！
  * 含有单细胞悬液的50mL离心管300g 4℃离心5分钟，用100-200μL左右的2% FBS/DPBS重悬，转移至15mL管中；
  * 每管加0.5 μL <mark style="color:red;">Human/Mouse Fc block</mark> 4℃避光孵育10min；
  * 300g 4℃离心5分钟；
  * 将颗粒重悬于最终体积为100-200 μL的2% FBS/DPBS溶液中，每管加入抗人/鼠CD45流式抗体（0.5μL）和live\&dead（0.5μL，<mark style="color:red;">APC通道</mark>）；
  * 冰上孵育30min；或室温15分钟；
  * 在30分钟的孵育时间内，在15mL离心管内加入4-5mL DMEM完全培养基，作为收集管（要覆盖底部和侧壁）；
  * 抗体孵育结束后，加入1mL 2%FBS/DPBS来洗涤样品；
  * 300g 4℃离心5分钟，弃上清，将颗粒重悬浮于1 mL 2%FBS/DPBS中；
  * 将样品避光放在冰上，直至FACS分选；
  * 将流式分选粒径设为100μm；
  * 通过在FSC-A和SSC-A点图中选择细胞室来设置门控策略。使用FSC-A和FSC-H排除双细胞，选择活死的阴性部分，并对CD45和GFP/mCherry的阳性细胞进行门控；
  * 分选L/D-GFP/mCherry+的肿瘤细胞，用于后续提蛋白、提RNA以及体外培养。
  * 备注：NSG鼠分选人肿瘤细胞可以省略FcBlock和CD45抗体染色步骤，只需要染活死染料。

## 三）肝脏肿瘤细胞DTC分离

* 参考文献：Metastatic recurrence in colorectal cancer arises from residual EMP1+ cells
* 目的：分离没有明显转移灶的肿瘤拨散细胞。
* 实验步骤：
* 1、分离肝脏，PBS润洗，用剪刀将肝脏彻底剪碎；
* 2、将组织用200 U/ml的collagenase IV (Sigma-Aldrich, v900893) （根据批次查询，Lot #WXBF3069V为205U/mg，约为1mg/mL；贮存浓度为100mg/mL含有钙镁的HBSS缓冲液） 37℃消化30分钟，用<mark style="color:red;">100μm滤网</mark>过滤（仍会有一些肿瘤细胞残留在滤网上）；
* 3、进一步消化：把滤网置于6孔板上，用含有200 U/mL collagenase IV, 200 μg/mL dispase II (Sigma-Aldrich, D4693), 40 μg/mL DNase I (Sigma-Aldrich, 10104159001) 和 13 μM rock inhibitor (MedChem Express, HY-27632，DMSO溶解)的HBSS溶液将其浸没，37℃再消化30min；
* 4、将滤过液用PBS洗涤、ACK或氯化铵破红、抗体染色；
* 5、分选GFP+CD45−的活细胞，即为肿瘤细胞。

<figure><img src="/files/2JOf2Rx2cZpsd6mlK1h1" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

<figure><img src="/files/Gi7I1nQslWfUtdlwxK4a" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

## 四）肝脏非实质细胞分离

* 参考文献：Isolation of mouse Kupffer cells for phenotypic and functional studies/Comprehensiveanalysisof liver macrophage composition by flow cytometry and
  \
  immunofluorescence in murine NASH
* 处死小鼠，用 70% 乙醇消毒腹部，剖开腹腔，轻轻暴露肝脏，去除胆囊并切断肝脏周围韧带，将肝脏放入冰冷 RPMI 1640 中备用
* 将肝脏切成 1–2 mm³ 小块，或用注射器底部研磨，放入 50 mL 离心管中，加入 10 mL 37℃ 预热的酶解液（RPMI +胶原酶-透明质酸酶（10×）+ DNase I）
* 37℃孵育 30 分钟，每 10 分钟轻轻震荡
* 使用 5mL注射器（配50mL注射器针头）将组织反复推送 7–8 次，机械均质
* 通过 70 μm 细胞筛过滤，10 mL RPMI洗涤
* 50 rcf 离心 3 分钟，回收上清，弃去肝实质细胞和碎片
* 400 rcf 离心 5 分钟，沉淀为非实质肝细胞（LNPCs）
* ACK 处理红细胞 30 秒-1min，加入 20 mL RPMI 中和，400 rcf 离心 5 分钟
* 4℃ 重悬于 10 mL 冰冷 RPMI，70 μm过滤
* 混合台盼蓝计数活细胞
* 离心后200μL PBS重悬，添加小鼠anti-CD16/CD32，4℃ 10min
* 取部分细胞悬液至单染管及Blank管，单独添加抗体，其余添加抗体混合液，4℃ 30min
* PBS洗后上机


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