小鼠肿瘤单细胞悬液制备
By J.Y. & K.Y
（一）普通皮下瘤
一、前期准备
1、消化酶配置：
美天旎肿瘤分选KIT（https://www.miltenyibiotec.com/CN-en/products/tumor-dissociation-kit-mouse.html#130-096-730
Enzyme D：试剂盒内有2管冻干粉，每管溶于3mL DMEM或RPMI 1640，按1mL分装冻于-20℃；
Enzyme R：试剂盒内有1管冻干粉，用2.7mL DMEM或RPMI 1640溶解，200μL分装冻于-20℃；
Enzyme A：试剂盒内有1管冻干粉，用 1mL Buffer A重悬，不要vortex，100μL分装冻于-20℃；
如细胞有培养需求，酶D应该过滤除菌；
2、试剂及耗材准备
手术器械：眼科剪（锋利的）、镊子若干
溶液：1 × PBS、DMEM（无添加）、ACK红细胞裂解液、Percoll、Ficoll、ddH2O；
试剂：流式抗体（包括活死染料、FcBlock）、Cocktail（Invitrogen，Cell Stimulation Cocktail plus protein transport inhibitors）、IC fixation（Invitrogen，Intracellular (IC) Fixation Buffer）、破膜缓冲液（Invitrogen eBioscience，Permeabilization Buffer (10X)）、破核固定液（Invitrogen，Fixation/Permeabilization Concentrate + Fixation/Permeabilization Diluent）、RPMI 1640完全培养基；
耗材：15/50mL离心管（可以提前1天标记好样本），1.5 mL EP管，抗凝采血管，巴式吸管，100μm滤网，流式管及流式管架；
其他：碎冰、冰盒；
二、取材
1、肿瘤免疫细胞
(1) 将小鼠肿瘤小心剥离，去除脂肪、纤维化、坏死灶部位，放入PBS浸泡，沥干水后放入EP管，在冰上用眼科剪尽量将肿瘤组织剪碎成肉糜（2-4mm）。
(2) 配制消化液（2.35mL DMEM+100μL酶D+10μL酶R+12.5μL酶A），吸取消化液2.5mL至50mL离心管中，用巴氏吸管吸取消化液至EP管中与肿瘤组织混匀，将EP管中肿瘤组织转移至50mL离心管中与消化液混合。
【 注意 】：目的细胞如为肿瘤细胞，Enzyme R可用50μL/管；目的细胞如为浸润免疫细胞，应减至10μL/管
(3) 37℃恒温摇床（或使用 gentleMACS Dissociator）180rpm消化30-60min（每15分钟观察消化状态）。消化期间可以标记流式管。
(4) 取出50mL离心管，将消化液用100μm滤网过滤至另一50mL离心管中，用PBS涮洗离心管，加PBS至35mL，离心。
(5) 弃上清，加PBS至4mL重悬，吹打混匀（如果红细胞较多可以用ACK裂解液破红再离心）。
【步骤6-10为可选】
(6) 配制70%和40%的percoll；在15mL离心管中先加入4mL 70%的percoll，再倾斜离心管，用巴氏吸管沿壁缓慢添加4mL 40%的percoll（可以用DMEM配制），最后用巴氏吸管沿壁缓慢添加4mL肿瘤细胞悬液。
(7) 上机，密度梯度离心，升降速设置为 0，2000rpm 离心 30min。
(8) 离心后，用移液器将上层肿瘤细胞吸走，留下40%/70%percoll及两层中间的免疫细胞共6mL。
(9) 用巴氏管吸取云雾层免疫细胞至50mL离心管中，加大量PBS，颠倒摇晃混匀（目的是稀释混匀percoll，便于离心），离心4℃，700g，7min。
(10) 弃上清，加1mL PBS/DMEM重悬，吹打混匀细胞。
2、外周血单个核细胞
(1) 摘小鼠眼球取血至抗凝管中，使用PBS 1：1 稀释样本（或添加至1mL）。
(2) 在流式管中加入与稀释前全血样本相同体积的Ficoll（1mlL），倾斜流式管，用移液枪沿壁缓慢小心加入1mL血浆（注意不要让两层混合）。
(3) 密度梯度离心，升降速设置为 0，2000rpm, 30min。
(4) 用巴式吸管小心吸取PBS和Ficoll层交界处云雾状的单核细胞层至另一流式管中，加PBS至10-15mL，混匀。
(5) 离心，弃上清。
(6) 如果吸取红细胞过多，加入3-5mL ACK破红，裂解3-5min（破红视情况而定，若几乎没有红细胞不应裂红，裂解液对细胞有一定损伤）。
(7) 加入PBS离心，弃上清。重悬细胞（PBS或者DMEM均可）。
三、表染
外周血样本与肿瘤内浸润免疫细胞样本可以同时进行染色。
1、取细胞悬液（将细胞悬液均分至表染、胞染、核染等panel中，表染可以稍微少一些，参考：150μL）至流式管中，加2mL PBS洗净培养基。
2、离心500g 5min，倒掉PBS，在纸上沥干液体，刮架子重悬细胞。
3、加Fc Block 4℃避光孵育10min，配体系的时候可以多配一点PBS（如六个管加160μLPBS和3μL FC Block）。
4、加2mL PBS洗去FC block，4℃离心500g/5min。沥干液体，重悬细胞。（FC Block不洗掉也可以）。
5、挑出空白管、单染管：
空白管（Blank管）：每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至空白管；
单染管：每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至各单染管，单染管加单个抗体，其他管加混合抗体；
6、用PBS配置表染抗体，L/D每样本管加0.2μl，BV加0.25μL，其他抗体加0.5μL；每个样本管加50/25μL抗体体系，单染管单独加。避光4℃孵育30min。
7、取出流式管，加2mL PBS，离心500g 5min，弃上清（不需要沥干水珠），刮架子重悬。
8、加100-200μL的PBS（可不加），上机。如果不能立刻上机，加入100-200μL IC fixation固定（最后加入的液体量视细胞数量而定，一般是100-200μL）。
四、核染
1、取细胞悬液（液体量见上）至流式管中，加2mL PBS。
2、离心500g 5min，倒掉PBS，沥干液体，刮流式管架重悬细胞。
3、加FC Block 4℃避光孵育10min。
4、加2mL PBS洗去Fc Block，4℃离心500g/5min。
5、挑出空白管、单染管：
空白管（Blank管）：每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至空白管，后续同样需要进行破核；
单染管：每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至各单染管，单染管加单个抗体（核染抗体的单染管先不加抗体，破核固定后再加抗体）；
每管吸取一定量液体（视情况而定）混合分配至各单染管，单染管加单个抗体，其他管加混合抗体。
6、配表染抗体，每管加50/25μL体系，避光4℃孵育30min；单染管单独加。
7、加2mL PBS，4℃ 离心 500g/5min，倒掉PBS，沥干水珠。
（以上同表染步骤）
8、每个样本管加入1mL新鲜配制的破核固定液。室温固定40min（小鼠细胞样本可在2-8°C下避光孵育最多18小时）。
9、每管加入2mL 1×破膜液，洗去固定液， 4℃ 500g 离心5min。
10、弃上清，刮流式管架混匀。重复洗一次。正式染色前把液体沥干，最终体积调至约100 μL。
11、设置：
FMO：从每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至FMO管，该管后续不添加Foxp3抗体。
12、用1×破膜液（1×Perm）配置核染抗体（50/25μL体系）。
13、除FMO管和空白管外，其余样本管添加核染抗体，室温避光染色40min。
14、染色后加2mL 1×破膜液，500g 4℃ 离心5min,，沥干液体。该步骤重复一次。
15、洗完后加PBS / 1×破膜液，上机。
五、胞染
1、向各样本的细胞悬液加入2mL PBS。500g 离心5min，倒掉PBS，在纸上沥干液体，刮架子重悬细胞。
2、上述样本离心期间，配置含有准备Cocktail的T细胞培养基：
取24/48孔板并标记样本孔，取500 ×Cocktail（保存于-20℃）置于冰上；
根据需要的孔数（24孔板每孔500μL培养体系，48孔板每孔100-150μL，细胞浓度在3×10^6个细胞/mL左右），取一定量RPMI 1640完全培养基，加入Cocktail（500×）
3、将流式管内细胞沉淀用上述培养基重悬，转移至24/48孔板。
4、静置于37℃培养箱，刺激4-5小时。
5、取细胞悬液至流式管中，加2mL PBS洗净培养基。
6、离心500g 5min，倒掉PBS，沥干液体，刮架子重悬细胞。
7、加Fc block 4℃避光孵育10min。加2mL PBS洗去FC block，4℃离心500g/5min。
8、挑出空白管、单染管：
空白管（Blank管）：每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至空白管，后续同样需要进行破膜；
单染管：每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至各单染管，单染管加单个抗体（胞染抗体的单染管先不加抗体，破膜固定后再加抗体）；
9、配表染抗体，每管加50/25μL体系，避光4℃孵育30min。
10、取出流式管，加2mL PBS，离心500g 5min，弃上清（不需要沥干水珠），刮架子重悬。
（以上同表染步骤）
11、加入100μL 胞内固定液（IC fixation）来固定细胞，混匀样本，室温避光孵育1h，4℃下可以存放过夜。
12、加2mL 1×破膜液，4℃离心500g 5min，弃上清。该步骤重复一次。加100μL 1×破膜液重悬细胞。
13、设置FMO管：
FMO：从每个样本管吸取一定量细胞悬液分配至3个FMO管，每管单独缺少GZMB/IFNG/Peforin抗体。
14、配制胞染抗体：用1X破膜液配制，避光保存，50μL体系。
15、除空白管外，加入流式胞内抗体（FMO管少加1种抗体），室温避光孵育20-60分钟。
16、加入2mL 1×破膜液，在室温下500g/5min，弃上清。该步骤重复一次。
17、加PBS/破膜液重悬细胞，上机。
（二）原发/转移肿瘤消化
参考文献：Tumor dissociation of highly viable cell suspensions for single-cell omic analyses in mouse models of breast cancer
前期准备
提前清点试剂；
将培养箱和水浴开至37℃，离心机4℃预冷；
准备手术器械：提前洗净的剪刀、镊子，紫外辐照30min；
准备耗材：备15毫升、50毫升、1.5毫升离心管若干，巴式吸管若干；
配置流式鞘液：10×PBS+ddH2O稀释；
准备流式抗体：如L/D 抗体，CD45抗体；
准备0.25%胰酶、ACK裂红液、Dispase II粉末，解冻胶原酶-透明质酸酶（10×）、DNase（1mg/mL），倒取100mL DPBS，置于冰上。
对每个样本，准备一个15 mL 离心管，每管加入4.5 mL 5%FBS/DMEM高糖培养基；
配置贮存液
配置胶原酶-透明质酸酶（10×）
配置胶原酶贮存液：取出Collagenase I 粉末(Sigma-Aldrich, v900891) ，根据批次查询，Lot #WXBF1554V为285U/mg；先用含有钙镁的HBSS缓冲液溶解为浓度100mg/mL贮存液。
配置胶原酶-透明质酸酶混合液（10×）
如配置50mL（10×）：50mL DMEM中溶解 150,000 U 胶原酶I（Sigma V900891），50,000 U透明质酸酶（Sigma H3506-1G）；
如配置10mL（10×）：10mL DMEM中溶解30000U （105 mg） 胶原酶I（约1mL的100mg/mL贮存液）和10000U 透明质酸酶（已稀释成10mg/mL贮存液，约需1-2mL）；
最后将10×混合液在1.5 mL EP管中等分，在20℃下储存直至使用；
DNase Ⅰ (1mg/mL）
将100 mg DNase溶解在100 mL DPBS中；
在1.5 mL EP管中等分，在20℃下储存直至使用；
1 × TEG (可用商业化0.25% Trypsin-EDTA代替)
将10 mL 2.5%胰蛋白酶（Gibco 15090-046）稀释在90 mL DPBS中，制备0.25%胰酶储备液；
将40 mg EGTA（Sigma E3889-25G）和10 mg聚乙烯醇（Sigma P8136250G）溶解在0.25%胰蛋白酶中（可能需要vortex）；
在1.5 mL EP管中等分，在20℃下储存直至使用；
Dispase II溶液（现用现配）
将25mg Dispase II重悬于5mL DPBS中（5mg/mL），充分混合。将溶液保持在20℃-22℃；
红细胞裂解液（可用商品化ACK裂解液代替）
将4.15克氯化铵（Sigma A9434-500G）溶解在50mL 0.1M Tris-HCl和450mL ddH2O中；
将pH值调节至7.5+/-0.2，4℃保存；
商品化的ACK裂解液：配方一般是 8.29g/L NH₄Cl、1.0g/L KHCO₃和 0.0372g/L EDTA，pH 值为 7.2 - 7.4
5% FBS/ DMEM High Glucose
将25 mL FBS稀释在475 mL 高糖DMEM中；
在4℃下可储存1个月；
2% FBS/DPBS
在490 mL DPBS中稀释10 mL FBS；
在4℃下可储存1个月；
肿瘤获取
分离肿瘤，用DPBS（如有分离培养需求可添加1%双抗）润洗3次，用剪刀将组织剪碎为3-5mm的肉糜匀浆（越碎越好），加到4.5 mL 5%FBS的DMEM高糖培养基中；
将500 μL胶原酶-透明质酸酶（10×）加入到含有样品和4.5 mL 5%FBS/DMEM的15 mL 离心管；
在培养箱中，以200 rpm的速度在37℃下与1×胶原酶-透明质酸酶一起振荡30分钟（可视情况延长）；孵育15分钟时，为确保组织充分再悬浮，用巴式吸管上下移液至少10次，破坏组织；尽管仍可观察到肉眼可见的肿瘤块，但浑浊的非半透明介质表明组织已被适当消化；
流式提前开机质控；
加入10mL冷DPBS来中和消化从而清洗样品，300g 4℃离心5分钟，弃上清；
用100μL DNase溶液重悬沉淀；
加入750 μL 胰酶，在37℃水浴中上下移液1分钟；
用2%FBS/DPBS补至15 mL，300g 4℃离心5分钟，弃上清；
向每管中加入1.25 mL Dispase溶液，在37℃的水浴中孵育5分钟，300g 4℃离心5分钟，弃上清；
将沉淀重悬于50 μL DNase溶液和450 μL 2%FBS/DPBS；
加入2mL红细胞裂解液，重悬，在37℃水浴下孵育2分钟；
用2%FBS/DPBS补至15 mL中和，300g 4℃离心5分钟，弃上清（此时沉淀应为白色）；
【这一步开始将样品置于冰上！】
将沉淀重新悬浮于5-10mL冷的2%FBS/DPBS中，并使用70mm滤器过滤到50mL离心管中；
台盼蓝计数细胞，制备密度在1 × 10^6 - 1 × 10^7/mL的单细胞悬浮液；
流式分选（全部步骤在4℃进行）；
确保流式提前开机质控！
含有单细胞悬液的50mL离心管300g 4℃离心5分钟，用100-200μL左右的2% FBS/DPBS重悬，转移至15mL管中；
每管加0.5 μL Human/Mouse Fc block 4℃避光孵育10min；
300g 4℃离心5分钟；
将颗粒重悬于最终体积为100-200 μL的2% FBS/DPBS溶液中，每管加入抗人/鼠CD45流式抗体（0.5μL）和live&dead（0.5μL，APC通道）；
冰上孵育30min；或室温15分钟；
在30分钟的孵育时间内，在15mL离心管内加入4-5mL DMEM完全培养基，作为收集管（要覆盖底部和侧壁）；
抗体孵育结束后，加入1mL 2%FBS/DPBS来洗涤样品；
300g 4℃离心5分钟，弃上清，将颗粒重悬浮于1 mL 2%FBS/DPBS中；
将样品避光放在冰上，直至FACS分选；
将流式分选粒径设为100μm；
通过在FSC-A和SSC-A点图中选择细胞室来设置门控策略。使用FSC-A和FSC-H排除双细胞，选择活死的阴性部分，并对CD45和GFP/mCherry的阳性细胞进行门控；
分选L/D-GFP/mCherry+的肿瘤细胞，用于后续提蛋白、提RNA以及体外培养。
备注：NSG鼠分选人肿瘤细胞可以省略FcBlock和CD45抗体染色步骤，只需要染活死染料。
三）肝脏肿瘤细胞DTC分离
参考文献：Metastatic recurrence in colorectal cancer arises from residual EMP1+ cells
目的：分离没有明显转移灶的肿瘤拨散细胞。
实验步骤：
1、分离肝脏，PBS润洗，用剪刀将肝脏彻底剪碎；
2、将组织用200 U/ml的collagenase IV (Sigma-Aldrich, v900893) （根据批次查询，Lot #WXBF3069V为205U/mg，约为1mg/mL；贮存浓度为100mg/mL含有钙镁的HBSS缓冲液） 37℃消化30分钟，用100μm滤网过滤（仍会有一些肿瘤细胞残留在滤网上）；
3、进一步消化：把滤网置于6孔板上，用含有200 U/mL collagenase IV, 200 μg/mL dispase II (Sigma-Aldrich, D4693), 40 μg/mL DNase I (Sigma-Aldrich, 10104159001) 和 13 μM rock inhibitor (MedChem Express, HY-27632，DMSO溶解)的HBSS溶液将其浸没，37℃再消化30min；
4、将滤过液用PBS洗涤、ACK或氯化铵破红、抗体染色；
5、分选GFP+CD45−的活细胞，即为肿瘤细胞。
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