常用细胞操作

By KaiyiFu

一、细胞传代

1、开紫外，照射台面30min;
2、取新培养瓶若干，写上实验人员名、日期、细胞系名称；取出写有自己名字的培养基（4℃冰箱）、PBS（常温）、胰酶（4℃）、细胞冻存液与冻存管（如需要）;培养基与胰酶置于37℃培养箱预热。
3、取出培养基，在显微镜下观察细胞密度（70%-80%），弃去原有培养液【高高举起，远离桶口】
4、用5-10毫升1xPBS洗去细胞碎片与残留的培养液，注意贴壁加液，切勿直接冲向细胞。弃去PBS;
5、对于T75培养瓶培养的贴壁细胞，加胰酶3~5毫升【薄薄覆盖底部一层即可，为防止过度消化可以加3mL随后吸出2mL】【T25小培养瓶加1mL左右即可，润洗底部后可直接吸出】，来回晃动瓶子，使得胰酶能够覆盖整个瓶底；等待1-2分钟；悬浮细胞可在吹匀后直接加入新培养瓶，并补充培养基；
6、显微镜下观察消化情况，有细胞开始大块脱落即可用手拍落细胞，加入含血清培养基终止消化；
（如直接传代见步骤7；如铺板则直接离心、重悬、计数、铺板）
7、对于T75培养瓶，消化较为完全时加入培养基6-8毫升，终止消化，再加入15-20毫升培养基（悬空加，防止污染培养基），反复抽吸，打散混匀，分装入各个培养基（1：5分装）【25T则加入5mL左右新培养基】
8、如要冻存：胰酶消化细胞步骤如前，然后离心，弃去上清，重悬，计数。随后加入无血清细胞冻存液（每管1ml）重悬，加入冻存管。
9、酒精喷洒台面，关灯，紫外线照射30min

二、细胞计数、铺板

0、实验开始前，将所需要的试剂一次性端进超净台：分装的细胞培养基、胰酶等。
1、弃去旧培养液，用PBS轻柔清洗，吸尽废液；
2、消化细胞：在培养瓶内加胰酶3毫升【小培养瓶加1mL左右即可，6孔板500μL】，平稳十字晃动瓶子，使得胰酶能够覆盖整个瓶底，放入培养箱消化；
3、终止消化：等待3-5分钟，至细胞开始大块脱落，反复拍打，加入胰酶2-3倍体积以上的培养液终止消化（操作要快一点，防止细胞死亡）；
4、收集细胞悬液至15mL离心管，1000转离心5分钟，吸去上清（尽量吸干），加入5-6mL细胞培养液进行重悬；
5、吸取10μL细胞与10μL台盼蓝（台盼蓝可将死细胞染为蓝色），混匀，加入细胞计数板（8μL即可），用细胞计数仪进行计数【平拿平放】
6、在超净台内打开孔板，混匀细胞悬液，依据测得的细胞浓度加入适量的细胞悬液（悬空操作，避免污染）【12孔板，每个孔至少需要5*10^5细胞的量；如个别孔不需要细胞，则加入同等体积PBS】

6孔板：每孔先预铺1mL培养基，再用移液器吸取1mL悬液沿孔壁用力吹入板底。

24孔板：每孔一般接种500μL细胞，沿壁添加。

96孔板：每孔接种100μL细胞，沿壁添加，移液器不需要打到最大量程，每铺完一行换枪头同时轻轻混匀细胞悬液。

7、在各个孔板内依次加入培养基【12孔板每孔约2mL】
8、盖上板盖，顺时针摇晃3次，逆时针摇晃3次，然后沿X轴Y轴水平摇动3次，或用移液枪吹打混匀每个孔板，可降低细胞聚团或不均匀生长；放入细胞培养箱后，再横向纵向水平摇动3次。
9、在孔板上标记日期、细胞系、姓名，放入培养箱继续培养。

三、细胞冻存

1、当细胞培养至对数生长期晚期，但未进入平台期之前，也就是生长密度达到90%以上未到100%之前，此时贴壁生长的细胞依然处于单层细胞状态。将该细胞消化，并进行计数。
2、然后通过调整细胞悬液体积，将细胞密度调整为2X10^6～2X10^7/mL。与此同时，准备好细胞冻存液（标有Cell Saving存于4℃冰箱侧壁）。
3、将配置好的冻存液与细胞悬液按照体积1:1的比例进行混合，转移到冻存管内，做好标记，完成密封。
4、接下来，按照4度半小时、-20度一小时、-80度过夜的顺序逐步将冻存管的温度下降。如果实验室内有程序降温盒，则可以直接将冻存管放入盒内，实现温度的稳步下降。
5、最后，将冻存管从-80度转移至液氮罐内，进行长期保存。

注意事项：

在冻存之前，确保细胞状态良好。包括：细胞生长密度符合上述规定、细胞无污染、细胞形态良好没有变异。
DMSO可以溶解部分滤膜，如果要进行过滤，应该选择不会被DMSO降解的滤器，并且操作时务必带手套。
冻存管的管盖并不是拧得越紧越好，因为管盖内有O型橡胶圈，拧得太紧会让其变形，造成泄漏。当然，太松也会泄漏。
细胞冻存的密度应该要比传代时的密度要高得多，假如传代时的密度是1X10^ 5/mL，那么冻存时可以将密度提高到100倍。等到了复苏后，再将密度稀释为1/20也依然能保持较高的生长密度，但与此同时，残留的DMSO对细胞的影响则会大大降低。
冻存应遵循慢冻，复苏则相反，应快速升温。慢冻的原因是为了避免降温时，细胞内的水分还未来得及脱离细胞，但却形成冰晶，对细胞造成损伤。但也要注意，慢冻不等于无限制的缓慢降温，因为太慢，也会促成水分形成冰晶。最理想的降温速度应该是1度/分钟的下降速度。

四、细胞复苏

实验前准备：

1、打开B2的水浴锅，设置温度37摄氏度。
2、提前15分钟准备好全营养培养基，在15ml离心管中加入9mL的培养基，在25T/75T培养瓶中加入适量培养基，置于37℃培养箱。
3、准备一个泡沫盒，取一定干冰，用干冰掩盖细胞冻存管保温。

复苏步骤：

1、从液氮/干冰中取出冻存管（大约是7管细胞对应3瓶T75培养瓶，1管对应1瓶25T）；
2、将细胞冻存管放入水浴锅，不停晃动直至完全溶解，解冻后立即取出；
3、用酒精湿巾擦拭管壁，在超净台内将冻存管中细胞转移至带有培养基的离心管；
4、125g (rcf)，离心5min，弃去上清；
5、加入新鲜的含血清培养基，吹匀，吸至细胞培养瓶中，写好名字、日期、细胞系，开始培养；

Tips：

细胞解冻时，由于冻存管管壁较厚、隔热，而导致水浴时间太长（2min还没融化）时，可以将水浴锅的温度调至40℃左右，可以缩短解冻时间。
提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间，可避免细胞房人满为患，超净台使用紧张，复苏1h后，还没有加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）
复苏细胞时一定要有耐心，因为有些细胞在复苏一星期后才会真正有起色。因而，尽管细胞在复苏三四天后没有任何动静，也不要轻易倒掉所有细胞，要耐心等待，两周后再做决定。

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一、细胞传代

1、开紫外，照射台面30min;

2、取新培养瓶若干，写上实验人员名、日期、细胞系名称；取出写有自己名字的培养基（4℃冰箱）、PBS（常温）、胰酶（4℃）、细胞冻存液与冻存管（如需要）;培养基与胰酶置于37℃培养箱预热。

3、取出培养基，在显微镜下观察细胞密度（70%-80%），弃去原有培养液【高高举起，远离桶口】

4、用5-10毫升1xPBS洗去细胞碎片与残留的培养液，注意贴壁加液，切勿直接冲向细胞。弃去PBS;

5、对于T75培养瓶培养的贴壁细胞，加胰酶3~5毫升【薄薄覆盖底部一层即可，为防止过度消化可以加3mL随后吸出2mL】【T25小培养瓶加1mL左右即可，润洗底部后可直接吸出】，来回晃动瓶子，使得胰酶能够覆盖整个瓶底；等待1-2分钟；悬浮细胞可在吹匀后直接加入新培养瓶，并补充培养基；

6、显微镜下观察消化情况，有细胞开始大块脱落即可用手拍落细胞，加入含血清培养基终止消化；

（如直接传代见步骤7；如铺板则直接离心、重悬、计数、铺板）

7、对于T75培养瓶，消化较为完全时加入培养基6-8毫升，终止消化，再加入15-20毫升培养基（悬空加，防止污染培养基），反复抽吸，打散混匀，分装入各个培养基（1：5分装）【25T则加入5mL左右新培养基】

8、如要冻存：胰酶消化细胞步骤如前，然后离心，弃去上清，重悬，计数。随后加入无血清细胞冻存液（每管1ml）重悬，加入冻存管。

9、酒精喷洒台面，关灯，紫外线照射30min

二、细胞计数、铺板

0、实验开始前，将所需要的试剂一次性端进超净台：分装的细胞培养基、胰酶等。

1、弃去旧培养液，用PBS轻柔清洗，吸尽废液；

2、消化细胞：在培养瓶内加胰酶3毫升【小培养瓶加1mL左右即可，6孔板500μL】，平稳十字晃动瓶子，使得胰酶能够覆盖整个瓶底，放入培养箱消化；

3、终止消化：等待3-5分钟，至细胞开始大块脱落，反复拍打，加入胰酶2-3倍体积以上的培养液终止消化（操作要快一点，防止细胞死亡）；

4、收集细胞悬液至15mL离心管，1000转离心5分钟，吸去上清（尽量吸干），加入5-6mL细胞培养液进行重悬；

5、吸取10μL细胞与10μL台盼蓝（台盼蓝可将死细胞染为蓝色），混匀，加入细胞计数板（8μL即可），用细胞计数仪进行计数【平拿平放】

6、在超净台内打开孔板，混匀细胞悬液，依据测得的细胞浓度加入适量的细胞悬液（悬空操作，避免污染）【12孔板，每个孔至少需要5*10^5细胞的量；如个别孔不需要细胞，则加入同等体积PBS】

6孔板：每孔先预铺1mL培养基，再用移液器吸取1mL悬液沿孔壁用力吹入板底。

24孔板：每孔一般接种500μL细胞，沿壁添加。

96孔板：每孔接种100μL细胞，沿壁添加，移液器不需要打到最大量程，每铺完一行换枪头同时轻轻混匀细胞悬液。

7、在各个孔板内依次加入培养基【12孔板每孔约2mL】

8、盖上板盖，顺时针摇晃3次，逆时针摇晃3次，然后沿X轴Y轴水平摇动3次，或用移液枪吹打混匀每个孔板，可降低细胞聚团或不均匀生长；放入细胞培养箱后，再横向纵向水平摇动3次。

9、在孔板上标记日期、细胞系、姓名，放入培养箱继续培养。

三、细胞冻存

1、当细胞培养至对数生长期晚期，但未进入平台期之前，也就是生长密度达到90%以上未到100%之前，此时贴壁生长的细胞依然处于单层细胞状态。将该细胞消化，并进行计数。

2、然后通过调整细胞悬液体积，将细胞密度调整为2X10^6～2X10^7/mL。与此同时，准备好细胞冻存液（标有Cell Saving存于4℃冰箱侧壁）。

3、将配置好的冻存液与细胞悬液按照体积1:1的比例进行混合，转移到冻存管内，做好标记，完成密封。

4、接下来，按照4度半小时、-20度一小时、-80度过夜的顺序逐步将冻存管的温度下降。如果实验室内有程序降温盒，则可以直接将冻存管放入盒内，实现温度的稳步下降。

5、最后，将冻存管从-80度转移至液氮罐内，进行长期保存。

注意事项：

在冻存之前，确保细胞状态良好。包括：细胞生长密度符合上述规定、细胞无污染、细胞形态良好没有变异。
DMSO可以溶解部分滤膜，如果要进行过滤，应该选择不会被DMSO降解的滤器，并且操作时务必带手套。
冻存管的管盖并不是拧得越紧越好，因为管盖内有O型橡胶圈，拧得太紧会让其变形，造成泄漏。当然，太松也会泄漏。
细胞冻存的密度应该要比传代时的密度要高得多，假如传代时的密度是1X10^ 5/mL，那么冻存时可以将密度提高到100倍。等到了复苏后，再将密度稀释为1/20也依然能保持较高的生长密度，但与此同时，残留的DMSO对细胞的影响则会大大降低。
冻存应遵循慢冻，复苏则相反，应快速升温。慢冻的原因是为了避免降温时，细胞内的水分还未来得及脱离细胞，但却形成冰晶，对细胞造成损伤。但也要注意，慢冻不等于无限制的缓慢降温，因为太慢，也会促成水分形成冰晶。最理想的降温速度应该是1度/分钟的下降速度。

四、细胞复苏

实验前准备：

1、打开B2的水浴锅，设置温度37摄氏度。

2、提前15分钟准备好全营养培养基，在15ml离心管中加入9mL的培养基，在25T/75T培养瓶中加入适量培养基，置于37℃培养箱。

3、准备一个泡沫盒，取一定干冰，用干冰掩盖细胞冻存管保温。

复苏步骤：

1、从液氮/干冰中取出冻存管（大约是7管细胞对应3瓶T75培养瓶，1管对应1瓶25T）；

2、将细胞冻存管放入水浴锅，不停晃动直至完全溶解，解冻后立即取出；

3、用酒精湿巾擦拭管壁，在超净台内将冻存管中细胞转移至带有培养基的离心管；

4、125g (rcf)，离心5min，弃去上清；

5、加入新鲜的含血清培养基，吹匀，吸至细胞培养瓶中，写好名字、日期、细胞系，开始培养；

Tips：

细胞解冻时，由于冻存管管壁较厚、隔热，而导致水浴时间太长（2min还没融化）时，可以将水浴锅的温度调至40℃左右，可以缩短解冻时间。
提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间，可避免细胞房人满为患，超净台使用紧张，复苏1h后，还没有加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）
复苏细胞时一定要有耐心，因为有些细胞在复苏一星期后才会真正有起色。因而，尽管细胞在复苏三四天后没有任何动静，也不要轻易倒掉所有细胞，要耐心等待，两周后再做决定。