蛋白临近标记（TurboID）

By Kaiyi

原理简介

• 传统蛋白互作技术的痛点：Co-IP实验虽可在细胞内进行，但其不仅对抗体的要求较高，且无法有效捕获瞬时或较弱的蛋白相互作用；而Pull down实验是一种体外亲和纯化技术，在一定程度上不能真实反应细胞内蛋白质之间的相互作用，还有一些其他的技术，如荧光共振能量转移（FRET）、生物发光能量共振转移（BRET）、时间分辨荧光（TRF）、均相时间分辨荧光（HTRF）、放大化学发光亲和均相检测（AlphaScreen）等由于存在光漂白作用或需要抗体即昂贵底物，应用范围受限等原因，无法全面鉴定蛋白互作。传统的亲和纯化-质谱技术(AP-MS)，不能有效地捕获瞬时的或较弱的蛋白相互作用，也不适用于低丰度的蛋白或疏水性较强的膜蛋白，且无法分辨蛋白相互作用发生的细胞区室化信息，存在较多的限制。然而，许多重要的信号转导蛋白如受体激酶以及细胞谱系发生的驱动因子往往具有上述特征，这很大地限制了我们对于细胞活动精细调控过程的认识。

• 邻近蛋白标记（Proximity labeling, PL）是研究活体细胞内蛋白互作组和亚细胞结构蛋白组的一项重 要技术，常用工具酶包括：抗坏血酸过氧化物酶 （Engineered Ascorbate Peroxidase, APEX）、大肠杆菌生物素连接酶BirA的R118G位点突变体-AMP（BirA R118G, BioID）以及BirA*定向进化的生物素连接酶TurboID。BioID是一种简单而无毒的方法，基于原核生物大肠杆菌生物素连接酶BirA突变体BirA对近距离蛋白生物素标记的识别。BirA/BirA连接酶是一种高度保守的酶，它催化生物素和三磷酸腺苷（ATP）生成一个反应性中间体，生物素–腺苷酸单磷酸酯（生物素-5'-AMP）。野生型BirA对生物素-5'-AMP表现出很高的亲和力和特异性，而突变型BirA（R118G）对生物素-5'-AMP的亲和力显著降低。TurboID是BioID的改进版本，通过蛋白工程改造使得生物素连接酶的活性大大增强(标记时间从18 hrs缩短至10 min），能够在更短的时间内完成标记。

• TurboID邻近蛋白标记（TurboID-based proximity labeling, TbPL）技术是将诱饵蛋白与TurboID融合，TurboID催化生物素形成biotin-5'-AMP，进而与邻近蛋白的赖氨酸结合，从而对邻近蛋白进行生物素标记。最后，利用链酶亲和素耦合磁珠富集纯化标记蛋白，并通过质谱的方式获得互作蛋白组。

实验设计

重点参考文献：

1、Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID

2、Proximity labeling in mammalian cells with TurboID and split-TurboID

• 载体构建：构建TurboID与目标蛋白的融合表达载体，中间可以加柔性连接linker，同时添加标签，标签尽量避免FLAG等赖氨酸含类高的序列；

• 载体构建验证：构建TurboID与目标蛋白的融合表达载体，Western验证条带大小；

• 细胞预处理：使用无生物素培养基培养48h，消除内源性生物素干扰；

参考文献：Subcellular localization shapes the fate of RNA polymerase III；CTDP1 and RPB7 stabilize Pol II and permit reinitiation

使用链霉抗生物素蛋白M280珠（11206D，invitorgen）制备低浓度生物素培养基。将500 mL M280珠粒与500 mL 培养基在4℃下孵育过夜；通过用0.22mm无菌过滤器过滤获得无生物素2i培养基。使用无生物素培养基和正常培养基以10:1的比例混合，制备用于TurboID培养的培养基。将C1DC2T细胞在低生物素培养基中培养5-7天。

• 标记动力学测试：（0/5/10/15/30/60min），一般采取30min；生物素浓度优化（1/5/10/15/30/50μM），一般采取50μM；

• 阴性对照设置：包括未转染细胞核未加生物素对照组，确保背景标记率＜5%；

实验步骤

• 转染质粒

• 启动标记：加入生物素，37℃孵育一段时间；

• 终止标记：用含有PPI的冰PBS冲洗3次；

• 细胞裂解：RIPA裂解液+超声破碎（3s×10次）；

• 捕获猎物：链霉亲和素磁珠4℃旋转结合2h；

• 洗脱检测：煮沸+SDS上样，Western验证