蛋白临近标记（TurboID）

By Kaiyi

原理简介

  • 传统蛋白互作技术的痛点：Co-IP实验虽可在细胞内进行，但其不仅对抗体的要求较高，且无法有效捕获瞬时或较弱的蛋白相互作用；而Pull down实验是一种体外亲和纯化技术，在一定程度上不能真实反应细胞内蛋白质之间的相互作用，还有一些其他的技术，如荧光共振能量转移（FRET）、生物发光能量共振转移（BRET）、时间分辨荧光（TRF）、均相时间分辨荧光（HTRF）、放大化学发光亲和均相检测（AlphaScreen）等由于存在光漂白作用或需要抗体即昂贵底物，应用范围受限等原因，无法全面鉴定蛋白互作。传统的亲和纯化-质谱技术(AP-MS)，不能有效地捕获瞬时的或较弱的蛋白相互作用，也不适用于低丰度的蛋白或疏水性较强的膜蛋白，且无法分辨蛋白相互作用发生的细胞区室化信息，存在较多的限制。然而，许多重要的信号转导蛋白如受体激酶以及细胞谱系发生的驱动因子往往具有上述特征，这很大地限制了我们对于细胞活动精细调控过程的认识。

  • 邻近蛋白标记（Proximity labeling, PL）是研究活体细胞内蛋白互作组和亚细胞结构蛋白组的一项重 要技术，常用工具酶包括：抗坏血酸过氧化物酶 （Engineered Ascorbate Peroxidase, APEX）、大肠杆菌生物素连接酶BirA的R118G位点突变体-AMP（BirA R118G, BioID）以及BirA*定向进化的生物素连接酶TurboID。BioID是一种简单而无毒的方法，基于原核生物大肠杆菌生物素连接酶BirA突变体BirA对近距离蛋白生物素标记的识别。BirA/BirA连接酶是一种高度保守的酶，它催化生物素和三磷酸腺苷（ATP）生成一个反应性中间体，生物素–腺苷酸单磷酸酯（生物素-5'-AMP）。野生型BirA对生物素-5'-AMP表现出很高的亲和力和特异性，而突变型BirA（R118G）对生物素-5'-AMP的亲和力显著降低。TurboID是BioID的改进版本，通过蛋白工程改造使得生物素连接酶的活性大大增强(标记时间从18 hrs缩短至10 min），能够在更短的时间内完成标记。

  • TurboID邻近蛋白标记（TurboID-based proximity labeling, TbPL）技术是将诱饵蛋白与TurboID融合，TurboID催化生物素形成biotin-5'-AMP，进而与邻近蛋白的赖氨酸结合，从而对邻近蛋白进行生物素标记。最后，利用链酶亲和素耦合磁珠富集纯化标记蛋白，并通过质谱的方式获得互作蛋白组。

  • 临近标记优点：

    • （1）高灵敏度：可以检测弱或瞬时相互作用

    • （2）空间特异性：标记半径较小（通常10-20 nm），能反映蛋白质在细胞内的真实邻近关系

    • （3）体内适用性：可在活细胞中进行标记，保留了生理环境；

  • 临近标记缺点：

    • （1）融合蛋白干扰：目标蛋白与标记酶融合可能影响其正常功能或定位

    • （2）标记范围有限：标记半径小，可能错过较远但功能相关的相互作用。

实验步骤

重点参考文献：

1、Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID

2、Proximity labeling in mammalian cells with TurboID and split-TurboID

  • 载体构建：

    • 构建TurboID与目标蛋白的融合表达载体，TurboID大小为35kDa，TurboID与目的蛋白中间可以加柔性连接linker（如GGGGS×2），同时添加V5、HA等标签，标签尽量避免FLAG等赖氨酸含类高的序列；

    • 如目的蛋白具有特殊定位（如核定位，内质网、线粒体定位），可以增加靶向引导序列；

    • 可选载体如：C1(1-29)-TurboID-V5 pCDNA3 (Addgene, 107173)

  • 载体构建验证：

    • 构建TurboID与目标蛋白的融合表达载体，Western验证条带大小；

    • 利用免疫荧光观察融合蛋白的细胞内的分布位置；

Proximity labeling in mammalian cells with TurboID and split-TurboID

  • 细胞预处理：使用无生物素培养基培养48h，消除内源性生物素干扰；

参考文献：Subcellular localization shapes the fate of RNA polymerase III；CTDP1 and RPB7 stabilize Pol II and permit reinitiation

使用链霉抗生物素蛋白M280珠（11206D，invitorgen）制备低浓度生物素培养基。将500 mL M280珠粒与500 mL 培养基在4℃下孵育过夜；通过用0.22mm无菌过滤器过滤获得无生物素2i培养基。使用无生物素培养基和正常培养基以10:1的比例混合，制备用于TurboID培养的培养基。将C1DC2T细胞在低生物素培养基中培养5-7天。

  • 细胞转染：

    • 设置未转染细胞组（±Biotin）、转染TurboID组（±Biotin）；

    • 用PEI或者lipo进行转染；

  • 添加生物素+提蛋白：

    • 对于需要添加Biotin的未转染组和TurboID组，分别用50μM生物素（提前用DMSO配置为10mM浓度的贮存液，可以设置1/5/10/15/30/50μM优化梯度）处理细胞30分钟（0/5/10/15/30/60min优化梯度）；

    • 用含PPI的冰PBS洗涤3-5次终止生物素化反应，然后将细胞收集至EP管，1000g离心3分钟；

    • 用RIPA缓冲液裂解细胞颗粒，在冰上孵育30分钟，并在21000g下离心30分钟；

  • 磁珠富集+洗涤：

    • 吸取部分上清液（2.5%）作为input，其余部分与链霉抗生物素蛋白磁珠（Pierce，88816）进行IP；

    • 轻轻混匀磁珠，对于每个样本，分别吸取50μL磁珠至1.5mL离心管（T150细胞用250μL磁珠），用磁力架吸附磁珠，吸弃上清；

    • 加入1mL RIPA 洗涤2次，磁力架吸附去上清；

    • 加入蛋白，在4°C下孵育4h（或过夜），磁力架吸附，收集上清（即flow-through，用于检查生物素化蛋白是否已从流通中耗尽，并在洗脱液中富集）；

    • 用RIPA裂解缓冲液（1mL）洗涤磁珠两次，每次室温下2分钟；

    • 用1M KCl（1mL）洗涤一次，常温下2分钟；

    • 用0.1 M Na2CO3（1mL）洗涤10s；

    • 用含有2 M尿素的10 mM Tris-HCl（pH 8.0，1mL）洗涤10s；

    • 再用RIPA溶解缓冲液洗涤两次（1mL），每次2分钟；

    • 最后一次洗涤后，将珠子重悬在1 ml RIPA裂解缓冲液中并转移到新的EP管中，取5%磁珠用于银染，其余用于洗脱；

    • 每管加入30μl的2×loading（2 mM生物素和20 mM dithiothreitol (DTT)），95°C加热10分钟；

    • 注：用SDS-PAGE加热洗脱磁珠，溶液会包含Streptavidin monomers & dimers，大小在53kDa和100+kDa；

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MAN0011642_Pierce_Streptavidin_Mag_Bead_UG.pdf
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  • WB验证：

    • 空白组以及TurboID±Biotin组的input及Streptavidine-pull down的蛋白一起跑SDS胶；

    • 上样设计：一块胶用标签抗体验证融合蛋白的正确表达，另一块重复胶验证蛋白成功被生物素化（即TurboID的活性）；

    • 使用NC膜转膜（也可以使用PVDF膜，但可能对高分子量蛋白质的吸附较低）；

    • 5%脱脂牛奶的TBST封闭1h；

    • TBST洗膜三次，每次5min；

    • 检测泛素化蛋白：

      • 配置含3% BSA的1×TBST（不能用脱脂奶粉，因为其中游离的生物素会干扰Streptavidine-HRP）：1mL 20×TBS + 19mL ddH2O + 10μL Tween20 + 0.6g BSA；

      • 用3% BSA的1×TBST将Streptavidine-HRP抗体（Thermo, N100；CST，#3999）稀释至0.3 μg/mL（约1：5000），室温孵育30-60min；

    • TBST洗膜三次，每次5min；

    • ECL显影：

      • 空白对照组与无biotin组应该只见到内源性生物素化条带（72，75，130kda左右，主要是 PCCA(有三个变体80kDa/77kDa/75kDa)、MCCC1 (80kDa)、PC(两个变体130kDa/58kDa)）；

      • 添加生物素组条带应更强；

    • 进一步WB验证目的临近蛋白在±Biotin组的差异情况；

Cellular ATP demand creates metabolically distinct subpopulations of mitochondria

  • 蛋白质谱

    • 前期进行小试，优化条件；

    • 蛋白质谱样品准备：每组1个T150培养瓶或2个T75，约需2*10^7个细胞；

    • 未转染空白对照+无Biotin对照+2个生物学重复+3次平行实验；

    • 同上，用链霉抗生物素蛋白磁珠进行富集；

    • 洗涤磁珠：用200μL的50 mM Tris-HCl（pH 7.5）洗涤2次，再用200μL含有2 M尿素的50 mM Tris-HCl（pH 7.5）洗涤1次；磁力架吸附后去上清；

    • 磁珠洗脱：在25°C下用80μL含有1 mM DTT和0.4μg胰蛋白酶及2 M尿素的50 mM Tris-HCL孵育磁珠1小时，同时以1000 rpm的速度振荡；

    • 用TMT法或者label-free的方法对蛋白进行定量；

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