细胞转染、慢病毒包装与转导

By Kaiyi & Yiyuan

Last updated 10 hours ago

细胞转染、慢病毒包装与转导

By Kaiyi & Yiyuan

概述

慢病毒转导，是指利用慢病毒载体将目的基因转入受体细胞后并使其稳定表达的一种方法，即携带目的基因的载体导入细胞后，通过载体所携带的逆转录酶、整合酶将目的基因整合到宿主细胞的基因组上，利用宿主的蛋白表达系统持续地表达外源基因。该慢病毒载体实际上是由人类免疫缺陷病毒改造而来，是一种常见的基因治疗载体。常见的慢病毒颗粒由三质粒系统或四质粒系统产生的，但二者效率差异较大，目前市售的慢病毒使用三质粒系统居多，但由于四质粒系统更具有安全性，也逐渐在推广使用。较其他载体而言，慢病毒载体可以感染非分裂期的细胞，使得慢病毒载体比其他载体更具有优势。同时，为提高慢病毒的感染效率，可以在转导体系中添加Polybrene（一种阳离子聚合物）。

1、慢病毒（Lentivirus）与逆转录病毒（γ-retrovirus）

都属于逆转录RNA病毒，可以整合入宿主细胞基因组，长期表达，构建稳转细胞株。
慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，但γ逆转录病毒只感染分裂中的细胞。
相较于慢病毒，逆转录病毒对鼠细胞感染效率更高。
慢病毒和γ-逆转录病毒包装质粒不能互换。逆转录病毒可用pUMVC（包含gag，pol），普通包膜质粒，如VSV-G，可在两个系统中使用。
引入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，可以增加未剪接的RNA分子的数量，导致靶细胞中转基因表达的增加。

2、慢病毒三质粒系统

为提高载体的生物安全性，目前多采用载体三质粒系统
1、转移质粒（Transfer plasmid）：含有目的基因。两端具有LTR（长末端重复）序列，可促进转移质粒序列整合到宿主基因组中。Transfer plasmid容纳外源基因长度的能力是有限的。尽管理论上，在LTR之间可以插入的基因长度约为8.5 kb，但超过3 kb就会导致包装效率降低。而整个质粒过大，也会导致转染效率降低，进而影响最后的滴度。插入片段的大小，是我们不能控制的，但我们可以尽量选择较小的transfer plasmid骨架（如无必要，不要携带其他元件如GFP等）。

2、包膜质粒（Envelope plasmid）：如pCMV-VSV-G（搭配pCMV-dR8.9）和pMD2.G（搭配pSPAX2），为VSV病毒的包膜G蛋白，拥有广阔的宿主范围。VSV-G进入细胞依赖LDL-R，一些原始造血细胞缺乏LDL-R，可以使用猫内源性逆转录病毒(RD114)包膜糖蛋白增强转导。

3、包装质粒（Packaging plasmid）：如pCMV-dR8.9和pSPAX2，编码Gag，Pol，Rev，Tat基因。

试剂与材料

主要材料：病毒质粒、293T 细胞
Opti-MEM培养基：用于混合转染复合物
病毒收获培养基：含2-5%FBS的培养基（可以再加入1%BSA，0.22 µm过滤，以提高病毒滴度）
293T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS +1%双抗 + 1% GlutMax
转染试剂：PEI（Polyethylenimine聚乙烯亚胺，阳离子聚合物，稀释为1mg/mL），Lipo等
PEI （PolySciences货号#24765-100）配置方法：100mg PEI溶于100mL Milli-Q水，用1 mol/L NaOH滴定至 pH为7.0，用0.22μm滤膜过滤，分装。
PEG8000：聚乙二醇，用于浓缩病毒
Polybrene (聚凝胺，10 mg/mL)：用于感染实验
1.5 mL EP 管、15/50mL离心管、高速离心机

实验步骤

Day0（7:00pm）：细胞准备（293T铺板）

消化贴壁293T细胞，离心，细胞计数
取3-5×10^6细胞铺于10cm皿或T25瓶（可直接用无抗培养基铺板），过夜培养至密度达到70-90%

Tips：293T细胞的状态非常重要，细胞越大，转染效率越高。需要保证每次包装病毒时细胞的代数不超过10代。同时尽量不要使用国产血清。复苏后的细胞需要传2代后才能进行病毒的包装，并且传代后18-24h需要密度达到80%左右。

Day1 （4:00pm/10:00pm）：慢病毒包装转染

稀释液A液配置：取 1.5 ml 无菌 EP 管，根据质粒的浓度（前期测定得到），将包装质粒（dR8.9/pSPAX2）、包膜质粒（VSVG/pMD2.G）、转移质粒（目的基因）配比为7.5μg：5μg：10μg（3：2：4），添加至500μL opti-MEM（无血清无双抗）中，移液枪轻柔混匀20次后室温静置5min；
注意：上述为T75的细胞培养瓶，T25则用量减为1/3，T150用量翻倍；稀释液A+B的体积最好在总培养基体积的5-10%；PEI-质粒的比例在 1 ：1至 4：1之间优化（首次推荐使用 2 - 3：1）。

包装质粒pCMV-dR8.9 (psPAX2)

7.5μg

x μL

包膜质粒pCMV-VSV-G (pMD2.G)

5μg

y μL

目的基因

10μg

z μL

Opti-MEM

500μL

稀释液B液配置：取 1.5 ml 灭菌旋盖EP 管，取PEI（1μg/mL）50μg（50μL）添加到500μL opti-MEM（无血清无双抗）中，移液枪轻柔混匀20次后室温静置5min；

PEI（1mg/mL）

50μg

50μL

Opti-MEM

500μL

将B液逐滴滴加至A液中，每加一次移液枪轻柔混匀一遍，室温静置20min（这个时间处理细胞：对于T25瓶，取10mL DMEM培养基（最好无血清）37℃预热，在加转染试剂前吸掉原有培养基，用PBS洗一遍）；
细胞加样：用移液器轻轻上下吹打混合液3次，将静置好的转染试剂（A+B）缓缓滴加到293T细胞中（10cm皿或T25），在滴加过程中轻柔晃动培养板，使转染试剂均匀扩散；
在培养6-7h时，将培养基预热至 37 ℃；培养6-8h后将培养基更换为新鲜的含2-5%FBS的培养基（10-12mL），换液时贴壁加，动作轻柔以防细胞漂起。

选择opti-MEM的原因：血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子载体对核酸的结合，影响转染效率。另外，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞，引发细胞毒性，导致转染效率降低，故不能有血清转染。

转染后6-8h换低浓度血清培养液的原因：减少转染试剂（PEI/脂质体）对细胞的损伤，适当减缓H293T细胞的生长速度。

Day2/3：观察

细胞转染后24h可以看到荧光蛋白的表达；
48h后可以进行荧光照片采集，判断转染效率，生长状态良好可收获第一次上清，换液；

Day4：收毒及浓缩

转染48/72h后收取病毒上清于15/50mL离心管中，离心机提前预冷，于4℃，3000rpm离心10min，去除细胞碎片；
用注射器吸取上清（吸不到的话可以抽出活塞直接往注射器针筒里倒），并经0.45μm滤膜（黄色）过滤至15/50mL离心管；
加入病毒液1/3体积的PEG8000，过夜4℃浓缩。
当晚铺板需要感染的细胞（如肿瘤细胞）。

PEG8000配置方法：将80g PEG-8000, 14g NaCl 溶解于 80mL dd H2O，加入 120mL 1×PBS，振荡混匀，使固体全部溶解。用NaOH将pH值调为7.0-7.2。高压蒸汽灭菌，或用0.2μm的滤器过滤，存于4℃。

Day5：收毒分装、目的细胞铺板

将病毒液1600G 4℃离心 60min；
弃上清，如原有30mL上清，则加入500ul-1mL opti-mem无血清培养基重悬（原上清液体积与重悬液体积约为30-50：1），重悬时避免产生气泡；
将重悬液吸取至一离心管，12000rpm离心2-3分钟；
取上清液，按照每份100ul分装于冻存管，-80度冰箱保存；

病毒每冻融一次，病毒滴度会下降2-4倍；

一般情况下，病毒液于 -80 ℃ 中可保存 1 年，但建议半年之后重新检测病毒滴度；

一个T150的293T产毒量大概能感染1 ml（2E6 浓度）PBMC扩出来的T细胞；

Day6：目的细胞感染（慢病毒转导）

-80℃拿出来的病毒在37℃迅速解冻，跟解冻细胞一样；
- 悬浮细胞：需要加Ploybrene再Spinfection：细胞浓度在1-4*10^6，向病毒液中加入1000X的Ploybrene（10mg/mL，每1mL体系加1μL），整个孔板室温1000g离心90min，使病毒和细胞充分接触；
- 贴壁细胞：直接向病毒液中加1000X的Polybrene，使最终每1mL培养基体系对应1μLPolybrene，再向目的细胞加入病毒上清；
收集细胞，去除病毒上清；检测感染效率；

Day7-Day9：观测

每日观察荧光发光情况，悬浮细胞适时传代、补培养液，贴壁细胞适时消化、传代。

慢病毒操作手册

Previous分子克隆-同源重组 NextshRNA/RNP脂质体转染

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概述

1、慢病毒（Lentivirus）与逆转录病毒（γ-retrovirus）

都属于逆转录RNA病毒，可以整合入宿主细胞基因组，长期表达，构建稳转细胞株。
慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，但γ逆转录病毒只感染分裂中的细胞。
相较于慢病毒，逆转录病毒对鼠细胞感染效率更高。
慢病毒和γ-逆转录病毒包装质粒不能互换。逆转录病毒可用pUMVC（包含gag，pol），普通包膜质粒，如VSV-G，可在两个系统中使用。
引入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，可以增加未剪接的RNA分子的数量，导致靶细胞中转基因表达的增加。

2、慢病毒三质粒系统

为提高载体的生物安全性，目前多采用载体三质粒系统
1、转移质粒（Transfer plasmid）：含有目的基因。两端具有LTR（长末端重复）序列，可促进转移质粒序列整合到宿主基因组中。Transfer plasmid容纳外源基因长度的能力是有限的。尽管理论上，在LTR之间可以插入的基因长度约为8.5 kb，但超过3 kb就会导致包装效率降低。而整个质粒过大，也会导致转染效率降低，进而影响最后的滴度。插入片段的大小，是我们不能控制的，但我们可以尽量选择较小的transfer plasmid骨架（如无必要，不要携带其他元件如GFP等）。

2、包膜质粒（Envelope plasmid）：如pCMV-VSV-G（搭配pCMV-dR8.9）和pMD2.G（搭配pSPAX2），为VSV病毒的包膜G蛋白，拥有广阔的宿主范围。VSV-G进入细胞依赖LDL-R，一些原始造血细胞缺乏LDL-R，可以使用猫内源性逆转录病毒(RD114)包膜糖蛋白增强转导。

3、包装质粒（Packaging plasmid）：如pCMV-dR8.9和pSPAX2，编码Gag，Pol，Rev，Tat基因。

试剂与材料

主要材料：病毒质粒、293T 细胞
Opti-MEM培养基：用于混合转染复合物
病毒收获培养基：含2-5%FBS的培养基（可以再加入1%BSA，0.22 µm过滤，以提高病毒滴度）
293T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS +1%双抗 + 1% GlutMax
转染试剂：PEI（Polyethylenimine聚乙烯亚胺，阳离子聚合物，稀释为1mg/mL），Lipo等
PEI （PolySciences货号#24765-100）配置方法：100mg PEI溶于100mL Milli-Q水，用1 mol/L NaOH滴定至 pH为7.0，用0.22μm滤膜过滤，分装。
PEG8000：聚乙二醇，用于浓缩病毒
Polybrene (聚凝胺，10 mg/mL)：用于感染实验
1.5 mL EP 管、15/50mL离心管、高速离心机

实验步骤

Day0（7:00pm）：细胞准备（293T铺板）

消化贴壁293T细胞，离心，细胞计数
取3-5×10^6细胞铺于10cm皿或T25瓶（可直接用无抗培养基铺板），过夜培养至密度达到70-90%

Day1 （4:00pm/10:00pm）：慢病毒包装转染

稀释液A液配置：取 1.5 ml 无菌 EP 管，根据质粒的浓度（前期测定得到），将包装质粒（dR8.9/pSPAX2）、包膜质粒（VSVG/pMD2.G）、转移质粒（目的基因）配比为7.5μg：5μg：10μg（3：2：4），添加至500μL opti-MEM（无血清无双抗）中，移液枪轻柔混匀20次后室温静置5min；
注意：上述为T75的细胞培养瓶，T25则用量减为1/3，T150用量翻倍；稀释液A+B的体积最好在总培养基体积的5-10%；PEI-质粒的比例在 1 ：1至 4：1之间优化（首次推荐使用 2 - 3：1）。

包装质粒pCMV-dR8.9 (psPAX2)

7.5μg

x μL

包膜质粒pCMV-VSV-G (pMD2.G)

5μg

y μL

目的基因

10μg

z μL

Opti-MEM

500μL

稀释液B液配置：取 1.5 ml 灭菌旋盖EP 管，取PEI（1μg/mL）50μg（50μL）添加到500μL opti-MEM（无血清无双抗）中，移液枪轻柔混匀20次后室温静置5min；

PEI（1mg/mL）

50μg

50μL

Opti-MEM

500μL

将B液逐滴滴加至A液中，每加一次移液枪轻柔混匀一遍，室温静置20min（这个时间处理细胞：对于T25瓶，取10mL DMEM培养基（最好无血清）37℃预热，在加转染试剂前吸掉原有培养基，用PBS洗一遍）；
细胞加样：用移液器轻轻上下吹打混合液3次，将静置好的转染试剂（A+B）缓缓滴加到293T细胞中（10cm皿或T25），在滴加过程中轻柔晃动培养板，使转染试剂均匀扩散；
在培养6-7h时，将培养基预热至 37 ℃；培养6-8h后将培养基更换为新鲜的含2-5%FBS的培养基（10-12mL），换液时贴壁加，动作轻柔以防细胞漂起。

转染后6-8h换低浓度血清培养液的原因：减少转染试剂（PEI/脂质体）对细胞的损伤，适当减缓H293T细胞的生长速度。

Day2/3：观察

细胞转染后24h可以看到荧光蛋白的表达；
48h后可以进行荧光照片采集，判断转染效率，生长状态良好可收获第一次上清，换液；

Day4：收毒及浓缩

转染48/72h后收取病毒上清于15/50mL离心管中，离心机提前预冷，于4℃，3000rpm离心10min，去除细胞碎片；
用注射器吸取上清（吸不到的话可以抽出活塞直接往注射器针筒里倒），并经0.45μm滤膜（黄色）过滤至15/50mL离心管；
加入病毒液1/3体积的PEG8000，过夜4℃浓缩。
当晚铺板需要感染的细胞（如肿瘤细胞）。

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Homemade 4fold lentivirus concentrator.pdf

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Day5：收毒分装、目的细胞铺板

将病毒液1600G 4℃离心 60min；
弃上清，如原有30mL上清，则加入500ul-1mL opti-mem无血清培养基重悬（原上清液体积与重悬液体积约为30-50：1），重悬时避免产生气泡；
将重悬液吸取至一离心管，12000rpm离心2-3分钟；
取上清液，按照每份100ul分装于冻存管，-80度冰箱保存；

病毒每冻融一次，病毒滴度会下降2-4倍；

一般情况下，病毒液于 -80 ℃ 中可保存 1 年，但建议半年之后重新检测病毒滴度；

一个T150的293T产毒量大概能感染1 ml（2E6 浓度）PBMC扩出来的T细胞；

Day6：目的细胞感染（慢病毒转导）

-80℃拿出来的病毒在37℃迅速解冻，跟解冻细胞一样；
- 悬浮细胞：需要加Ploybrene再Spinfection：细胞浓度在1-4*10^6，向病毒液中加入1000X的Ploybrene（10mg/mL，每1mL体系加1μL），整个孔板室温1000g离心90min，使病毒和细胞充分接触；
- 贴壁细胞：直接向病毒液中加1000X的Polybrene，使最终每1mL培养基体系对应1μLPolybrene，再向目的细胞加入病毒上清；
收集细胞，去除病毒上清；检测感染效率；

Day7-Day9：观测

每日观察荧光发光情况，悬浮细胞适时传代、补培养液，贴壁细胞适时消化、传代。