# Transwell+划痕实验

### Transwell实验原理

* Transwell实验，也称为Transwell迁移或侵袭测定，是一种用于细胞生物学和分子生物学的实验室技术，用于研究细胞通过多孔膜的运动。它通常用于研究细胞对各种刺激(如生长因子、趋化因子或细胞外基质成分)的迁移、趋化性和侵袭。Transwell实验对于评估细胞通过多孔屏障迁移或侵袭的能力特别有用，多孔屏障模拟细胞必须穿过体内组织的生理条件。Transwell实验涉及Transwell小室(插入物)和孔板，它们是一种由分隔两个隔室的渗透膜组成的装置。 通常，顶部室充满细胞，而底部室包含化学引诱剂或诱导细胞迁移的物质。多孔膜允许细胞通过膜上的小孔从顶部室迁移到底部室。
* Transwell实验根据是否在小室内添加基质胶分为两种类型：**迁移测定(未在小室内添加基质胶)：**在这种类型的测定中，细胞从顶部室迁移到底部室，但不需要降解或侵入膜。 这种类型的测定测量细胞响应化学引诱剂梯度而移动的能力。**侵袭测定(需在小室内添加基质胶)：**在侵袭测定中，细胞不仅通过多孔膜迁移，还需要通过通常涂覆在膜顶部的细胞外基质(ECM)层降解或侵袭。例如，侵袭测定通常用于研究肿瘤细胞的侵袭行为。Transwell实验是体外研究细胞行为的重要工具，可以深入了解各种生物过程，包括癌症转移、免疫细胞迁移和组织发育。通过计算小室底部或培养液内迁移或入侵的细胞数量，或通过测量各种细胞参数(例如细胞运动和趋化反应)的变化来量化细胞行为。

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2Fy9FzcvpUZUsck8xG5WPV%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=6bc5320b-9178-44cc-8328-1ad466f24411" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

### 实验步骤

* 实验前1-2天：观察细胞生长状态，取生长状态良好的细胞去培养基，加入无血清培养基<mark style="color:red;">饥饿24h</mark>。
* 基质胶铺板（用Corning® BioCoat™ Matrigel® 包被侵袭小室则可省去该步骤）：
  * 取出分装后的基质胶，<mark style="color:red;">提前30min于4℃解冻</mark>，随后置于冰/冰盒上。
  * 取若干Transwell小室，置于24孔板。将 tip 头、EP 管、放有 Transwell 小室的 24 孔板和无血清培养基<mark style="color:red;">提前 4 ℃ 预冷</mark>，实验前转移到冰盒中。
  * 将基质胶用无血清培养基进行1：8（或1：6）稀释，即12.5μL基质胶原液加100μL无血清培养基，吹打混匀吸取100 μL稀释液，垂直加入Transwell上室，<mark style="color:red;">均匀平铺</mark>在底部，<mark style="color:red;">避免气泡</mark>；
  * 将24孔板置于37℃培养箱孵育30-60min观察到汇合成薄膜；
  * 孵育后将上室中多余液体吸掉，在每孔中加入100 µL无血清培养基后，于培养箱放置30min，进行基底膜水化。
  * 将上室中液体吸掉，检查是否有液体穿过小室进入到下室中，若没有，则可以接种细胞。
* 细胞消化，300g 离心3min，用<mark style="color:red;">无血清的培养基</mark>重悬，计数；
  * 对于未加基质胶的迁移实验，用无血清培养基配制样本，将工作液浓度设置成终浓度的2倍（即<mark style="color:red;">5×10^5/mL</mark>）；随后按样本：细胞悬液=100μL：100μL的比例加入到小室内，加样时尽量垂直小室底部在小室底部中间加入，可避免气泡的产生。
  * 对于加了基质胶的侵袭实验，用无血清培养基配置成适合浓度的（可以比相同条件下的迁移实验适当多铺一点数量）100μL的细胞悬液，轻轻滴加至基质胶薄膜上；

{% hint style="info" %}
不同细胞的迁移和侵袭能力不同，可设置一系列细胞密度梯度摸索合适的细胞接种密度，MC38每孔<mark style="color:red;">50000</mark>个细胞穿12h，SW480每孔<mark style="color:red;">50000</mark>个细胞穿48h
{% endhint %}

* 在24孔板下室加入500-600µL含<mark style="color:red;">10%FBS培养基</mark>。然后用镊子将Transwell小室（Falcon #353097）置于24孔板内；

{% hint style="info" %}
注意：下层培养液和小室间经常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，<mark style="color:red;">去除气泡</mark>，再将小室放进培养板。
{% endhint %}

* 接种细胞后1-2h把培养板从培养箱里拿出来看看，<mark style="color:red;">确保没有大气泡产生；</mark>
* 12-48h后，取出Transwell小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭上室内的细胞。
* 在24孔板干净的孔中加入4％多聚甲醛600µL，将小室放入后固定20-30min（小室和膜上都无法标记，操作时应小心避免混淆实验组和对照组）。&#x20;
* 弃固定液，将小室在盛有PBS的6cm皿中涮洗1遍。（注意避免触碰到小室底部）
* 用0.1%结晶紫染色5-10min，PBS涮洗3遍，除去未与细胞结合的结晶紫，<mark style="color:red;">用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉</mark>，以便后续镜检。
* 适当风干后，显微镜下观察定性研究；10倍镜取3-5个视野（上、下、中央、左、右各1个）拍照后用ImageJ计数取平均值进行定量研究；5倍镜进行全局视野拍照。

### 划痕实验原理

* 划痕缩小是细胞迁移和细胞增殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移，若需要单纯的考虑细胞迁移，可以先用丝裂霉素（1μg/mL）处理1小时，抑制细胞的分裂；

### 实验步骤

* 先用Marker笔在6孔板背后<mark style="color:red;">划线</mark>，每隔0.5-1cm 1道，每孔穿过5条线；
* 细胞铺板，，5-8×10^5个细胞/孔，使细胞量尽量维持在过夜长满的状态；
* 细胞<mark style="color:red;">先不换液</mark>，用灭过菌的枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕（用力均匀一致，垂直稳定一气呵成，避免宽度差别较大不利于结果分析的准确性）；
* 吸去培养基，用PBS清洗细胞三次（贴壁轻柔加），尽量去除划下的细胞碎片；
* 加入<mark style="color:red;">无血清培养基</mark>（无血清培养基也可以降低增殖对实验结果的影响），0h拍照记录，记录各个固定点的图像；
* 对细胞进行处理（给药转染等），放于培养箱培养；
* 按0，6，12，24h的固定时间点取板，拍照记录；

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* 一般按0，6，12，24小时拍照，建议不要把观察时间设置的太长，因为很容易造成细胞污染死亡或者过度增殖造成的假阳性结果。
* 以预先做好的标记为定点观测点来进行定时拍照（选择处理/对照组迁移能力差异明显的时间点拍照，拍摄与0h拍照时的相同位置，放大倍数相同）。
* 拍照时标记线不要出现在视野内，而是刚好沿着标记线的边拍照。
* 细胞生长具有边缘效应，所以边缘细胞生长状态可能与中间的细胞不太一样，不宜作为观测点。
  {% endhint %}

### 实验步骤（ibidi插件）

* 调节细胞悬液至<mark style="color:red;">1×10^5/mL</mark>（MC38），1×10^6细胞/mL（SW480/SW620）。
* 放置划痕插件至12孔板（底部有黏性），两侧每孔加<mark style="color:red;">70μL</mark>细胞悬液，抵着<mark style="color:red;">四周的圆角</mark>加液可以避免气泡。
* 培养2-3天，直至细胞完全长满。
* 用无菌平头镊子移去插件（慢！稳！夹住中间的室间隔，垂直拔出），贴壁添加1mL培养基（慢！轻柔！）
* 4-8-12-16-24h拍照（显微镜调成PH0，黑白模式）。

### 数据分析

* 划痕实验统计分析主要有两种方法，一种是统计细胞迁移的距离；一种是统计划痕面积。
* ①细胞迁移距离：通过对初始划线（0h）和后期观察点的划痕的距离对比来判断。
* ②划痕面积：通过对初始划线（0h）和后期观察点的划痕的面积对比来判断。