# 慢病毒包装与转导

## 概述

慢病毒转导，是指利用慢病毒载体将目的基因转入受体细胞后并使其稳定表达的一种方法，即携带目的基因的载体导入细胞后，通过载体所携带的逆转录酶、整合酶将目的基因整合到宿主细胞的基因组上，利用宿主的蛋白表达系统<mark style="color:red;">持续地表达外源基因</mark>。

该慢病毒载体实际上是由<mark style="color:red;">人类免疫缺陷病毒（HIV-1）</mark>改造而来，是一种常见的基因治疗载体。HIV基因组长约9kb，具有三个主要编码片段，<mark style="color:red;">gag（组抗原）、pol（聚合酶）和env（包膜），两侧是两个长末端重复序列(LTR)</mark>。LTR是病毒基因组的功能元件，对于病毒转录和复制周期至关重要。gag基因编码结构蛋白：基质(MA)、衣壳(CA)、核衣壳(NC)和转框多肽(TF)。pol基因编码蛋白酶（PR）、逆转录酶（RT）和整合酶（IN）。第三个必需基因env编码包膜蛋白、表面蛋白(SU)和跨膜蛋白(TM)。

目前慢病毒载体已发展了很多代，其中2代和3代是应用较广。在第2代和第3代包装系统中，病毒的结构基因（gag、pol、env；其中env通常使用VSV-G）被分配到不同的质粒中，使得这些关键基因之间的功能可以分开控制，提高了包装系统的稳定性和安全性。其中，来自水疱性口炎病毒包膜糖蛋白G的病毒VSV-G蛋白替换天然Env糖蛋白增加了病毒稳定性，从而提高了生产和增加产生的病毒滴度。此外，这种蛋白质具有普遍存在的受体，可以靶向更广泛的细胞。

常见的慢病毒颗粒由三质粒系统或四质粒系统产生的，但二者效率差异较大，目前市售的慢病毒使用三质粒系统居多，但由于四质粒系统更具有安全性，也逐渐在推广使用。较其他载体而言，慢病毒载体可以感染非分裂期的细胞，使得慢病毒载体比其他载体更具有优势。同时，为提高慢病毒的感染效率，可以在转导体系中添加Polybrene（一种阳离子聚合物）。

### 1、慢病毒（Lentivirus）与逆转录病毒（γ-retrovirus）区别

* 都属于逆转录RNA病毒，可以整合入宿主细胞基因组，长期表达，构建稳转细胞株。
* 慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，但γ逆转录病毒<mark style="color:red;">只感染分裂中的细胞</mark>。
* 相较于慢病毒，逆转录病毒基于小鼠白血病病毒(MLV)，对<mark style="color:red;">鼠细胞</mark>感染效率更高。
* 慢病毒和γ-逆转录病毒包装质粒不能互换。<mark style="color:red;">逆转录病毒</mark>可用<mark style="color:red;">pUMVC</mark>（包含gag，pol），普通包膜质粒，如<mark style="color:red;">VSV-G</mark>，可在两个系统中使用。
* 引入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，可以增加未剪接的RNA分子的数量，导致靶细胞中转基因表达的增加。

### 2、慢病毒三质粒系统

* 为提高载体的生物安全性，目前多采用载体<mark style="color:red;">三质粒系统</mark>
* 1、转移质粒（Transfer plasmid）：两端具有LTR（长末端重复）序列，中间包含基本的顺式作用元件（Ψ、RRE，cPPT）以及**目的基因**。其中LTR可促进转移质粒序列整合到宿主基因组中。Transfer plasmid容纳外源基因长度的能力是有限的。尽管理论上，<mark style="color:red;">在LTR之间可以插入的基因长度约为8.5 kb</mark>，但超过3 kb就会导致包装效率降低。而整个质粒过大，也会导致转染效率降低，进而影响最后的滴度。插入片段的大小，是我们不能控制的，但我们可以尽量选择较小的transfer plasmid骨架（如无必要，不要携带其他元件如GFP等）。

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FWsysgxL4XubSdxqhDCqD%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=e1500e3e-51f7-4dc2-9230-024409aa6a44" alt=""><figcaption><p>转移质粒基本结构</p></figcaption></figure>

* 2、包膜质粒（Envelope plasmid）：如pCMV-VSV-G（搭配pCMV-dR8.9）和pMD2.G（搭配pSPAX2），为VSV病毒的包膜G蛋白，拥有广阔的宿主范围。VSV-G进入细胞依赖LDL-R，一些原始造血细胞缺乏LDL-R，可以使用猫内源性逆转录病毒(RD114)包膜糖蛋白增强转导。

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FivUCLygSQVN8sL6sqWis%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=0624cc81-6434-47cc-bd0b-55f1dd3d6072" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

* 3、包装质粒（Packaging plasmid）：如pCMV-dR8.9和pSPAX2，编码Gag，Pol，Rev，Tat基因。

### 3、诱导型慢病毒（Tet-on系统）

Tet-On：通过加入四环素或多西环素，从而导致基因表达的开启称为Tet-On。

例如：慢病毒载体<mark style="color:red;">pCW-Cas9</mark>（addgene，50661）搭配<mark style="color:red;">Lenti-sgRNA</mark>（addgene，104993）可以实现在细胞内条件性地表达cas9蛋白，实现条件性的基因敲除。将pCW-Cas9载体中的Cas9更换为其他目的基因片段，即可实现条件性的基因过表达。同理，PLKO tet on（addgene，21915）可以实现条件性基因敲降。

原理：

* tetO（tet operator）：在大肠杆菌中，tetO分为tetO1和tetO2，其中tetO2 与 TetR 的结合更强，并且对天然四环素操纵子系统的整体行为具有更强的影响，因此常见的调控质粒中的tetO一般都是tetO2。tetO2序列：TCCCTATCAGTGATAGAGA。<mark style="color:red;">一个tetO2可以结合一个TetR二聚体</mark>。常见的含有TRE的一些元件包括<mark style="color:red;">tight TRE promoter</mark>、TRE3G BI promoter、TRE3G promoter、TRE3GS promoter、TRE3GV promoter、TREmod/U6 promoter等，它们都是由7个拷贝的tetO2与不同的启动子组合在一起形成的四环素反应元件（Tetracychne Response Element, <mark style="color:red;">TRE</mark>）。
* rtTA（reverse tetracycline-controlled transactivator）：rtTA是由<mark style="color:red;">rTetR</mark>（reverse Tet repressor）和单纯疱疹病毒转录激活域<mark style="color:red;">VP16</mark>融合而成的蛋白。rTetR能只能在存在四环素或者Dox的情况下识别目标转基因 TRE 中的 tetO 序列，在DOX不存在的情况下不结合TetO。
* 四环素类抗生素：用作调控基因开关的四环素类抗生素有：四环素（Tetracycline）、四环素的衍生物多西环素（Doxycycline）。其中<mark style="color:red;">多西环素（Dox）</mark>是四环素调控系统的首选效应物。多西环素与 tTA 和 rtTA 的结合亲和力很高；因此，多西环素既可用于四环素开启系统，也可用于四环素关闭系统。
* Tet-On实现：生理条件下，rtTA与TRE不结合，由于缺少增强子，因此目的基因不表达；给于DOX后，DOX与rtTA的结合体与TRE结合，从而启动基因表达。

注意：

* 培养体系选择<mark style="color:red;">无四环素的血清</mark>；
* 诱导时添加多西环素浓度为<mark style="color:red;">1μg/mL</mark>，培养2-3天后，检测目的基因表达情况；
* 推荐设置不同的dox浓度及时间梯度，通过qPCR或者FLAG标签检测目的基因的过表达情况；

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2F9aS8fdMRv857AFn5pRjK%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=94b9eae3-0cbc-445c-9da9-943088360afe" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

### 4、病毒的滴度与MOI

* 平均每个细胞所含病毒基因数（M1）=病毒基因拷贝数/内参基因拷贝数

  <mark style="color:red;">病毒滴度（TU/ml）</mark>=（细胞数×稀释倍数×M1）/添加病毒体积（mL）×校正系数×1000
* <mark style="color:red;">感染复数(MOI)</mark> 指感染细胞时一个细胞的病毒感染单元。在实验中某种细胞感染达到80%时的 MOI定义为这种细胞的最适MOI (实际使用MOI根据实验要求而定）。MOI越高，细胞越难被感染。
* 慢病毒感染MOI计算：\ <mark style="color:red;">MOI=（病毒滴度×病毒体积）/细胞数目</mark>。
* 举例：滴度1x10^8 TU/mL 的慢病毒，感染MOI值为100的细胞，24孔板细胞接种量是5x10^4个，需要50μL病毒液。

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FiDy9TIgqgcL1GICZ4uA4%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=ad8f99f6-429c-4de5-b75b-1af782a48274" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

## 试剂与材料

* 主要材料：病毒质粒、293T 细胞
* Opti-MEM培养基：用于混合转染复合物
* 病毒收获培养基：含2-5%FBS的培养基（可以再加入1%BSA，0.22 µm过滤，以提高病毒滴度）
* 293T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS +1%双抗 <mark style="color:red;">+ 1% GlutMax</mark>
* 转染试剂：PEI（Polyethylenimine聚乙烯亚胺，阳离子聚合物，稀释为1mg/mL），Lipo等
* PEI （PolySciences货号#24765-100）配置方法：100mg PEI溶于100mL Milli-Q水，用1 mol/L NaOH滴定至 pH为7.0，用0.22μm滤膜过滤，分装。
* PEG8000：聚乙二醇，用于浓缩病毒
* Polybrene (聚凝胺，Merck #TR-1003-G，10 mg/mL)：用于感染实验
* 1.5 mL EP 管、15/50mL离心管、高速离心机

## 实验步骤

### Day0（7:00pm）：细胞准备（**293T铺板）**

* 消化贴壁293T细胞，离心，细胞计数
* 取3-5×10^6细胞铺于10cm皿或T25/T75瓶，过夜培养至密度达到70-90%；

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2F0DCU5VT9kAkGTlk7K3W3%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=eafa6c80-0638-4ee5-ab9f-43b5fe5da8cb" alt="" width="375"><figcaption><p>合适的细胞密度</p></figcaption></figure>

{% hint style="info" %}
Tips：293T细胞的状态非常重要，细胞越大，转染效率越高。需要保证每次包装病毒时细胞的代数不超过10代。同时尽量不要使用国产血清。复苏后的细胞需要传2代后才能进行病毒的包装，并且传代后18-24h需要密度达到80%左右。
{% endhint %}

### Day1 （4:00pm/10:00pm）：慢病毒包装转染

* <mark style="color:red;">（对于T75细胞培养瓶或10cm皿）</mark>稀释液A液配置：取 1.5 ml 无菌 EP 管，根据质粒的浓度（前期测定得到），将**包装质粒（pSPAX2）、包膜质粒（pMD2.G）、转移质粒（目的基因）配比为7.5μg：5μg：10μg（**<mark style="color:red;">**3：2：4**</mark>**），**&#x6DFB;加至500μL opti-MEM（无血清无双抗）中，移液枪轻柔混匀20次后室温静置5min；
* 注意：
  * 载体转染量根据<mark style="color:red;">细胞数量</mark>和<mark style="color:red;">质粒种类</mark>调整：如对于<mark style="color:red;">T25</mark>细胞培养瓶和<mark style="color:red;">delta 8.9/VSVG</mark>系统，可以采用2.25 µg **包装质粒（dR8.9/∆8.9**） + 0.25 µg **包膜质粒（pVSVG**） +  2.5 µg慢病毒质粒 （<mark style="color:red;">**9：1：10**</mark>）+ 25μL PEI（1μg/mL）+250μL opti-MEM；
  * 稀释液A+B的体积最好在总培养基体积的5-10%；PEI-质粒的比例在 1 ：1至 4：1之间优化（首次推荐使用 2 - 3：1）。

<table><thead><tr><th></th><th width="249.33333333333331"></th><th></th></tr></thead><tbody><tr><td>包装质粒pCMV-dR8.9 (psPAX2)</td><td>7.5μg</td><td>x μL</td></tr><tr><td>包膜质粒pCMV-VSV-G (pMD2.G)</td><td>5μg</td><td>y μL</td></tr><tr><td>目的基因</td><td>10μg</td><td>z μL</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td></td><td>500μL</td></tr></tbody></table>

* <mark style="color:red;">（对于T75细胞培养瓶或10cm皿）</mark>稀释液B液配置：取 1.5 ml 灭菌 旋盖EP 管，取PEI（1μg/mL）50μg（50μL）添加到500μL opti-MEM（无血清无双抗）中，移液枪轻柔混匀20次后室温静置5min；

|             |      |       |
| ----------- | ---- | ----- |
| PEI（1mg/mL） | 50μg | 50μL  |
| Opti-MEM    |      | 500μL |

* 将B液逐滴滴加至A液中，每加一次移液枪轻柔混匀一遍，室温静置20min（这个时间处理细胞：对于T25瓶，取10mL DMEM培养基（最好无血清）37℃预热，在加转染试剂前吸掉原有培养基，用PBS洗一遍）；
* 细胞加样：用移液器轻轻上下吹打混合液3次，将静置好的转染试剂（A+B）缓缓滴加到293T细胞中（10cm皿或T25/T75），在滴加过程中轻柔晃动培养板，使转染试剂均匀扩散；
* 在培养6-7h时，将培养基预热至 37 ℃；培养6-8h后将培养基更换为新鲜的含2-5%FBS的培养基（10-12mL），换液时贴壁加，动作轻柔以防细胞漂起。

{% hint style="info" %}
选择opti-MEM的原因：血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子载体对核酸的结合，影响转染效率。另外，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞，引发细胞毒性，导致转染效率降低，故不能有血清转染。

转染后6-8h换低浓度血清培养液的原因：减少转染试剂（PEI/脂质体）对细胞的损伤，适当减缓H293T细胞的生长速度。
{% endhint %}

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FRE8vCcnymoRUSj1uSKox%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=3dafa5ce-e89d-4e88-bb53-2fc728bda94f" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

### Day2/3：观察

* 细胞转染后24h可以看到荧光蛋白的表达；
* 48h后可以进行荧光照片采集，判断转染效率，生长状态良好可收获第一次上清，换液；

### Day4：收毒及浓缩

* 转染48/72h后收取病毒上清于15/50mL离心管中，离心机提前预冷，于4℃，3000rpm离心10min，去除细胞碎片；
* 用注射器吸取上清（吸不到的话可以抽出活塞直接往注射器针筒里倒），并经0.45μm滤膜（黄色）过滤至15/50mL离心管；
* 加入病毒液1/3体积的PEG8000，过夜4℃浓缩。
* 当晚铺板需要感染的细胞（如肿瘤细胞）。

{% hint style="info" %}
PEG8000配置方法：将80g PEG-8000, 14g NaCl 溶解于 80mL dd H2O，加入 120mL  1×PBS，振荡混匀，使固体全部溶解。用NaOH将pH值调为7.0-7.2。高压蒸汽灭菌，或用0.2μm的滤器过滤，存于4℃。
{% endhint %}

{% file src="<https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FaueCFZoBJbzx2LbgzKOk%2FHomemade%204fold%20lentivirus%20concentrator.pdf?alt=media&token=53daa888-cc9e-4b7e-b727-49346b03b126>" %}

### Day5：收毒分装、目的细胞铺板

* 将病毒液1600G 4℃离心 60min；
* 弃上清，如原有30mL上清，则加入500ul-1mL opti-mem无血清培养基重悬（原上清液体积与重悬液体积约为30-50：1），重悬时避免产生气泡；
* 将重悬液吸取至一离心管，12000rpm离心2-3分钟；
* 取上清液，按照每份100ul分装于冻存管，-80度冰箱保存；

{% hint style="info" %}
病毒每冻融一次，病毒滴度会下降2-4倍；

一般情况下，病毒液于 -80 ℃ 中可保存 1 年，但建议半年之后重新检测病毒滴度；

一个T150的293T产毒量大概能感染1 ml（2E6 浓度）PBMC扩出来的T细胞；&#x20;
{% endhint %}

### Day6：目的细胞感染（慢病毒转导）

* &#x20;-80℃拿出来的病毒在37℃迅速解冻，跟解冻细胞一样；&#x20;
  * 悬浮细胞：需要加Ploybrene再Spinfection：细胞浓度在1-4\*10^6，向病毒液中加入1000X的Ploybrene（<mark style="color:red;">10mg/mL</mark>，每1mL体系加1μL），整个孔板室温1000g离心90min，使病毒和细胞充分接触；
  * 贴壁细胞：直接向病毒液中加1000X的Polybrene，使最终每1mL培养基体系对应1μLPolybrene，再向目的细胞加入病毒上清；
* 收集细胞，去除病毒上清；检测感染效率；

### Day7-Day9：观测

* 加病毒24h后换液，或传代至更大的孔板；
* 一般加病毒48h后可以添加Puro或Bsd等抗生素进行筛选，对于片段较长的病毒可以延迟到72h后。
* 每日观察荧光发光情况（一般48h可观察到荧光）或抗生素筛选情况，悬浮细胞适时传代、补培养液，贴壁细胞适时消化、传代。

{% hint style="info" %}
**Puromycin在慢病毒感染的筛选中的作用机制：**

Puromycin是来源于Streptomyces alboniger的一种氨基核苷类抗生素，中文名为嘌呤霉素，常用于筛选通过质粒转染/转化、病毒感染等方法能表达pac基因(puror)的真核或原核多克隆或单克隆细胞。Puromycin不仅用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。Puromycin的特点是快速作用于细胞，一般2天内可以杀死99%的不表达pac基因的细胞。
{% endhint %}

### 慢病毒操作手册

{% file src="<https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2Fol86nhthL5JyGhPvDQyg%2F%E6%85%A2%E7%97%85%E6%AF%92%E4%BD%BF%E7%94%A8%E6%93%8D%E4%BD%9C%E6%89%8B%E5%86%8C.pdf?alt=media&token=60148e44-1daf-4698-aac7-ee3d4f94b709>" %}
吉凯基因
{% endfile %}

{% file src="<https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FePoc5UcxoVI9tWjXoa97%2F%E6%85%A2%E7%97%85%E6%AF%92%E6%93%8D%E4%BD%9C%E6%89%8B%E5%86%8C20220221.pdf?alt=media&token=e3d822c5-6245-4c2a-bdab-6d188a7c23c1>" %}
汉恒生物
{% endfile %}