# 分子克隆-无缝克隆

## 实验原理

* **分子克隆定义**：分子克隆技术是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。 用体外重组方法将目的基因插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而实现目的基因的扩增。
* **无缝克隆的原理**：在载体末端和引物末端应具有<mark style="color:red;">**15-25个同源碱基**</mark>（同源臂）。通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶，三种酶同时发挥功能，从而达到单片段或多片段与载体连接的技术。
  * T5核酸外切酶：5‘→3’端消化DNA片段，形成粘性末端；
  * DNA聚合酶：填补缺口；
  * DNA连接酶：两条DNA 单链黏合起来。

<figure><img src="/files/MZvjLtxIyNFCIR79lYjm" alt="" width="563"><figcaption><p>无缝克隆流程示意</p></figcaption></figure>

## 实验步骤

### 第0天：设计引物

#### 1、目的基因的获取

* 从NCBI获取基因序列。
* 小鼠Hpd基因（1179bp）：<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_008277.3>

#### 2、设计反应流程，设计引物：

* 设计反应流程：使用反向PCR扩增线性化载体，并与多片段进行Gibson连接
* 设计目的基因引物：
  * 1）在SnapGene-行动-Gibson Assembly上设计，同时可导出新的连接后的DNA序列（<https://www.snapgene.com/resources/gibson_assembly?referrer=SnapGene>）
  * 2）在<https://nebuilder.neb.com/#!/>设计无缝克隆引物
  * 3）在<https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/primer-design-and-other-tools>无缝克隆引物
* 下单引物

引物设计的基本原则如下：&#x20;

{% hint style="info" %}
① 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBl上搜索不同彻种的同一基因，通过序列分析软件 (比如DNAman比/对(Alignment)，各基因相同的序列就是该基因的保守区。

② 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp&#x20;

③ 引物GC含量在40%\~60%之间，Tm值最好接近72℃。且两条引物的Tm值越接近越好，相差不超过5℃。 Tm值:DNA缩解温度，指把DNA的双螺旋结构降解―半时的温度，亦即DNA变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度(Tm)。

④ 引物3'端要避开密码子的第3位且尽量避开使用A碱基。&#x20;

⑤ 自身及引物之间不应存在互补序列。 应避免发夹结构(Hairpin)、引物二聚(Dimer 与Crossdimer)&#x20;

⑥ 碱基要随机分布。&#x20;

⑦ 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。&#x20;

⑧ 引物的5′端可以修饰，而3'端不可修饰&#x20;

⑨ 扩增产物的单链不能形成二级结构。&#x20;
{% endhint %}

### 第0天：制备线性化的载体

#### 1、载体酶切线性化

* 使用EcoRI限制性内切酶线性化环状质粒，配置如下体系（不同品种的酶按各自说明书来）：

<table><thead><tr><th width="280.3333333333333">成分</th><th width="189">存放位置</th><th>体积</th></tr></thead><tbody><tr><td>10X CutSmart Buffer (NEB)</td><td>927 -20冰箱橙色盒</td><td>10μL</td></tr><tr><td>EcoRI Enzyme</td><td>927 -20冰箱橙色盒</td><td>7μL</td></tr><tr><td>DNA template </td><td></td><td>10μg (x μL)</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td>up to 100 μL</td></tr></tbody></table>

* 37℃反应5h，反应完毕后可直接进行电泳，也可冻至-20℃待用

#### 2、琼脂糖电泳与DNA纯化

#### 【配置电泳液与琼脂糖凝胶】

* 配置1X TAE：量筒量取980mL去离子水，20mL50x TAE，混匀溶解（TAE主要成分包含Tris/冰醋酸/EDTA）。重复配置一次，得到2L的1X TAE溶液（下一步电泳时也要用）。
* 配置琼脂糖溶液：天平称量1.5-2.0g琼脂糖，倒入锥形瓶，加入100mL 1X TAE溶液【小块胶则是0.5g琼脂糖与30mL TAE】，锥形瓶盖上盖子，微波炉高火加热1.5-2min；
* 一轮加热后，戴手套取出锥形瓶，观察溶化情况，并振荡混匀；再次加热1.5min，得到澄清溶液；
* 趁热加入10000× GelRed核酸染料【也可以在DNA体系中添加sybr green作为替代】，摇晃均匀。

#### 【琼脂糖电泳】

* 提前清洗胶板、齿梳；组装胶板与齿梳；
* 在确认胶板水平的情况下倒入琼脂糖溶液，按压，排出气泡；
* 静候冷却，凝胶成形。拔出齿梳。
* 打开电泳槽盖子，在电泳槽中加入足量1X TAE（液面可没过凝胶），放入凝胶【注意摆放的方向，有孔的一端朝左侧黑色负极，电泳槽上也有箭头】。
* 先在凝胶孔洞每排首尾各加2.5微升DNA Ladder（根据DNA分子量选择DL2000+或DL10000+的Ladder），用移液枪（或排枪）在孔中滴加样本混合液，每孔4-6微升（2-3微升Loading Buffer+2-3微升DNA溶液，如未在胶中添加GelRed，则需选用添加了SYBR Green的Loading Buffer）。
* 盖上盖子，接通电源（红对红，黑对黑），120V电压电泳20分钟；
* 显影观察（注意排气泡）。

注：核酸在凝胶中的速率取决于分子大小等，分子越小，迁移速度越快；进行Agarose电泳时，Agarose的浓度与DNA片段的分离性能关系密切。Agarose浓度越大，对短片段DNA分离性能越好；反之，Agarose浓度越小，越有利于长片段DNA的分离。

<figure><img src="/files/TJcfTNXdkEtWszsuiTXU" alt="" width="188"><figcaption></figcaption></figure>

<figure><img src="/files/8i7evS877upi7gDtd5NQ" alt="" width="185"><figcaption></figcaption></figure>

#### 【PCR产物回收纯化（QIAquick® PCR Purification Kit）】

* 向产物中加入5倍体积的Buffer PB（检查PB是否为黄色），混匀。
* 为了结合DNA，将上述溶液加到柱子中，12000 rpm离心2 min。
* 为了洗柱子，弃废液，再向柱子加入750 μL Buffer PE【注意添加乙醇！】，12000 rpm离心1 min。
* 弃废液，12000 rpm空离1 min。
* 将收集管换成1.5 mL离心管（用剪刀减去耳朵），加入30-50 μL Buffer EB或水洗脱DNA（注意EB加到滤膜上），室温静置1 min后，12000 rpm离心1 min。
* 使用Nano Drop系统测量回收产物浓度，注意使用相应的溶液做Blank。

### 第1天：目的基因的克隆

#### 1、配置PCR体系：

* 对于一般的PCR，用诺唯赞的2x Taq酶即可

| 成分                    | 体积         |
| --------------------- | ---------- |
| 2X Taq Master Mix     | 25μL       |
| cDNA：1-5μL；质粒DNA：10ng | 不等         |
| Forward Primer (10μM) | 2μL        |
| Reward Primer (10μM)  | 2μL        |
| ddH2O                 | up to 50μL |

{% file src="/files/7prg8gDPz5xeWN5hNfwh" %}
诺唯赞2X Taq酶说明书
{% endfile %}

* 2X Taq酶的一般反应条件

| 步骤             | 时间              |
| -------------- | --------------- |
| 95℃预变性         | 2min            |
| 以下步骤循环30次      |                 |
| 95℃变性          | 30s             |
| 55℃退火（根据引物Tm值） | 30s             |
| 72℃延伸（1kb/min） | 5min30s （5.5kb） |
| 72℃            | 10min           |
| 4℃             | 终止              |

* 如果目的基因GC含量高，或者片段较长（＞10kb），可以用Takara长链PCR酶

| 成分                                   | 体积         |
| ------------------------------------ | ---------- |
| TaKaRa Ex Premier DNA Polymerase(2X) | 25μL       |
| cDNA：500-1000ng；质粒DNA：100ng          | 不等         |
| Forward Primer (10μM)                | 1.5 μL     |
| Reward Primer (10μM)                 | 1.5 μL     |
| ddH2O                                | up to 50μL |

{% file src="/files/qtI2kzMWN4PmcEZItT39" %}
Takara长链PCR酶说明书
{% endfile %}

#### 2、反向PCR克隆线性化载体+克隆目的片段

1）线性化的MP71-WPRE逆转录病毒质粒载体

* 每管50μL，重复3管，用Takara酶

| 步骤                | 时间              |
| ----------------- | --------------- |
| 94℃预变性            | 1min            |
| 以下步骤循环30次         |                 |
| 94℃变性             | 10s             |
| 58℃退火（根据设置梯度温度得到） | 15s             |
| 68℃延伸（1kb/30s）    | 2min45s （5.5kb） |
| 68℃               | 10min           |
| 4℃                | 终止              |

2）MC38的cDNA-Hpd基因

* 每管50μL，重复3管。

| 步骤                | 时间          |
| ----------------- | ----------- |
| 94℃预变性            | 1min        |
| 以下步骤循环30次         |             |
| 94℃变性             | 10s         |
| 67℃退火（根据设置梯度温度得到） | 15s         |
| 68℃延伸（1kb/30s）    | 36s （1.2kb） |
| 68℃               | 10min       |
| 4℃                | 终止          |

3）对于HER2-CAR-GS质粒的T2A+TurboGFP片段

* 每管50μL，重复3管。

| 步骤                | 时间           |
| ----------------- | ------------ |
| 94℃预变性            | 1min         |
| 以下步骤循环30次         |              |
| 94℃变性             | 10s          |
| 60℃退火（根据设置梯度温度得到） | 15s          |
| 68℃延伸（1kb/30s）    | 25s （0.75kb） |
| 68℃               | 10min        |
| 4℃                | 终止           |

#### 3、琼脂糖电泳与凝胶回收

{% hint style="info" %}
如果电泳条带单一，不用胶回收，直接用试剂盒purification；

如果有<mark style="color:red;">非特异性条带或双酶切有较大差异的两条片段</mark>时，则需要胶回收纯化；
{% endhint %}

【采用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)试剂盒】

注意：当天现配琼脂糖凝胶和TAE电泳液（不能用重复回收的）；提前准备1.5mL 离心管，写完标签，放一个黄色枪头；

* 配置1.5%琼脂糖凝胶，趁热加入10000X的GelRed，倒入凝胶槽室温冷却 15 min。
* 将PCR或酶切产物与10x Loading Buffer混合（50μL每孔，45：5混合），首尾加DL10000/DL2000的DNA Marker 5μL，上样到琼脂糖凝胶上进行电泳（可以适量延长电泳时间，如30min，使条带尽可能分离）。
* 金属浴提前加热至50℃；
* 从琼脂糖凝胶上切下单一的目的DNA条带，放入干净的1.5 mL离心管中，进行称重。
* 加入3倍体积的Buffer QG到1体积的凝胶中。(100 mg大约等于100uL)
* 将离心管放入 50℃金属浴中，直到凝胶完全解。(此时溶液的颜色应变为黄色)
* 向离心管加入一个凝胶体积的异丙醇，上下翻转离心管，使液体混匀。
* 为了结合DNA，将上述样品加到柱子中，12000 rpm 离心1min。【如果离心管内液体体积较多，可以在同一个柱子中多次重复加样，离心回收DNA，以提高单管的DNA浓度】
* 弃废液，向柱子中加入 500 uL Buffer QG，12000rpm 离心1min。
* 为了洗柱子，弃废液，再向柱子加入 750 L Buffer PE，12000 pm 离心 1 min。&#x20;
* 弃废液，12000rpm 空离 1min。
* 将收集管换成1.5 mL离心管（用剪刀减去耳朵），加入30-50 uL Buffer EB 或水洗脱DNA(注意EB 加到滤膜上)，室温静置 1min 后，12000rpm 离心1min。
* 使用Nano Drop 系统测量回收产物浓度，注意使用相应的溶液做 Blank。

#### 4、Gibson连接

* 提前打一盆冰，或准备冰盒。将金属浴提前加热至50℃。
* 取出一管2X Gibson Assembly Master Mix (10 μL) 置于冰上融化，在冰上加入计算好的载体和插入片段的DNA混合物，用ddH2O补至20μL【也可以用10μL体系】。
* 载体推荐50-100ng。插入片段：载体片段的摩尔数是2：1。详见<https://nebuilderv1.neb.com/media/manualE2611.pdf>
* Gibson克隆所需DNA量的计算工具：<https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/primer-design-and-other-tools/in-fusion-molar-ratio-calculator>换算公式：pmols = (weight in ng) x 1,000 / (base pairs x 650 daltons)

| 成分                              | 体积                               |
| ------------------------------- | -------------------------------- |
| Gibson Assembly Master Mix (2X) | 10 μL                            |
| 载体片段                            | 117 ng（0.03pmol） = 4 μL          |
| Hpd基因片段（摩尔数是载体2倍）               | 51 ng（0.06pmol）= 2.5 μL          |
| T2A-GFP基因片段（摩尔数是载体2倍）           | 32 ng（0.06pmol） = 1 μL（先提前1：3稀释） |
| ddH2O                           | up to 20 μL                      |

* 加完DNA混合物之后，立刻用移液器轻轻吹打5-10次，随即将反应液放入50℃恒温金属浴中，孵育60分钟。
* 到时间后，及时将反应液取出置于冰上，用于转化感受态细胞；也可暂时保存在-20℃冰箱。

#### 5、琼脂糖电泳与DNA回收（可省略）

* 电泳查看重组质粒的条带位置（可省略）；
* 将Gibson连接产物收集至EP管，纯化回收，检测DNA浓度（可省略）；

### 第2天：质粒转化

* 将金属浴预热至42℃
* 取LB固体平板（加抗生素），吸取500μ的LB液体培养基（不加抗生素）至EP管，烘箱37℃预热
* 从-80冰箱取一管Top10/DH5α感受态细胞（一管100μL，一般一个质粒30-50μL够了），在冰上解冻
* 测量质粒DNA浓度，取1ng DNA（1μL），加入100μL感受态细胞中，轻弹管壁，冰上放置30min（不要吹打）
* 感受态细胞42℃热激1min
* 冰上孵育2min
* 向管内加入500μL预热的不含抗生素的LB液体培养基，吹打混匀
* 将管子置于孔板上，37℃，225rpm摇菌1h
* 5000rpm离心1min，弃去上清，用100μL培养基重悬
* 在LB固体平板【再三确认载体抗性！！！】内加入重悬的菌液，用涂布棒涂布，室温放置2min，使其充分吸收
* 待菌液吸收，倒置平板，37℃培养16h，可放置于4℃保存。

### 第3天：挑单克隆、扩增

* 生物安全柜内、酒精灯旁，准备10个离心管（15mL离心管+5毫升培养基），每管加一定量抗生素（如5mL培养基加5μL的1000X氨苄青霉素）；
* 酒精灯旁，用加样枪挑菌落，选择200μL黄枪头，挑完直接把抢头打进管子里。 37℃温箱内固定在摇床上，盖子不能盖紧，220rpm振摇过夜【16个小时】。
* 第二天培养基变得混浊，说明细菌生长良好。

### 第4天：质粒小提、酶切、跑胶、送测序

【质粒小提：Forgene General Mini Kit】（可省略，直接送测序）

* 每管吸取1mL培养基，取 1-5ml 培养 16-20hr 的菌液，加入离心管中，12,000rpm(\~13,400 ×g)离心 1min，尽量吸净残留上清
* 向留有菌体沉淀的离心管中加入 250μl Buffer S1，用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀，彻底悬浮细菌沉淀，直到看不见细菌团块
* 向离心管中加入 250μl Buffer S2，轻柔地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解直到溶液呈均一胶冻状。
* 向离心管中加入 350μl Buffer S3，立即上下颠倒 6-8 次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。 12,000rpm(\~13,400 ×g)离心 10min。
* 将上清液小心转移到离心柱中(DNA-Only Column)，12,000rpm(\~13,400 ×g) 离心 1min，弃掉收集管中的废液。
* 向离心柱中加入 500μl Buffer PW，3,000rpm(\~900 ×g) 低速离心 1min。弃掉收集管中的废液。
* 向离心柱中加入 700μl Buffer WB2(请再次检查 Buffer WB2 是否已添加了无水乙醇)， 12,000rpm(\~13,400 ×g)离心 1min，弃掉收集管中的废液。
* 重复上步骤一次。
* 将离心柱放回收集管中，12,000rpm(\~13,400×g)空管离心 2min，去掉离心柱中残余的 Buffer WB2。
* 将离心柱放到一个干净离心管【带旋盖的离心管】中，向硅胶膜中间位置滴加 50-200μl Buffer EB(切勿将洗脱液添加 到压圈上，否则会损失较大体积的洗脱液)，室温放置 2min。12,000 rpm (\~13,400 ×g )离心 1min 收集 DNA 溶液。
* NanoDrop测量DNA浓度，以Buffer EB作为blank。

【酶切线性化+琼脂糖电泳】（可省略，直接送测序）

* 用单/双酶切割载体，体系如下

<table><thead><tr><th width="306.3333333333333">成分</th><th width="189">存放位置</th><th>体积</th></tr></thead><tbody><tr><td>10X CutSmart Buffer (NEB)</td><td>927 -20冰箱橙色盒</td><td>5μL</td></tr><tr><td>EcoRI Enzyme</td><td>927 -20冰箱橙色盒</td><td>2.5μL</td></tr><tr><td>NotI/BsmI Enzyme</td><td>927 -20冰箱橙色盒</td><td>2.5μL</td></tr><tr><td>DNA template （小提得到的质粒）</td><td></td><td>5μg (33 μL)</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td>7 μL (up to 50 μL)</td></tr></tbody></table>

* 37℃反应2-5h，反应完毕后直接进行琼脂糖电泳，观察条带数量

【测序】

* 如条带位置正确，将小提得到的质粒送测序，引物尽量设计在片段相连区前200-300bp，这样可以同时观察3个片段的连接情况；
* 如测序结果无误，则可以进行质粒中提或大提，制备慢病毒。


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```

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