🔃免疫共沉淀 (Co-IP)
By Frederick & Marriana
实验原理
免疫沉淀 (Immunoprecipitation， IP ) 是指利用抗原抗体特异性反应从细胞/组织/血液混合物中富集纯化其特异性的靶标或抗原。
免疫共沉淀( Co-IP ) 指用抗体用于从混合样品中富集纯化其靶抗原及其结合蛋白。在这种情况下，抗原是诱饵蛋白，而其结合蛋白是通过抗体--抗原相互作用共同纯化的相互作用的蛋白。
通常利用Co-IP实验可以：
（1）测定两种甚至更多种蛋白质是否在体内结合；
（2）鉴定一种特定蛋白质的作用搭档；
（3）分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
Co-IP大致步骤：首先抗体对抗原（目的蛋白）进行特异性结合， 接着通过偶联在微珠上的亲和蛋白（如Protein A sepharose beads）对抗体Fc 端的结合形成“beads- 抗体- 目的蛋白”三联体，经洗涤去除未 结合的杂蛋白，然后SDS sample buffer 或酸性洗脱的方式使抗体、目的蛋白一起脱落下来，最后经 Western Blot 检测，胶片显影或仪器成像，观 察是否有目的蛋白带，来判断抗体是否成功捕获了目的蛋白。
名词解释
IB：即immunoblotting（免疫印迹）也就是常规的Western Blotting，用于检测目的蛋白。
IP：即immunoprecipitation（免疫沉淀）这一步主要是为了纯化富集目的蛋白。
Input：全细胞裂解液，可认为是阳性组。也就是处理完样本得到的细胞样品，在做IP实验之前，需要预留Input，在检测IP的结果同时确认样本中含有蛋白A和蛋白B。
Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗体。
IgG：Anti-A的同型对照抗体，即跟Anti-A同种属来源，如Anti-A是鼠源IgG型，则同型对照抗体需要选择Mouse IgG。
对照设置
Co-IP（免疫共沉淀）一般分为内源性和外源性，我们可以简单理解为内源性CO-IP是检测细胞本身含有的蛋白A和蛋白B互作有无；外源性CO-IP是将蛋白A和蛋白B在细胞内过表达后，再检测二者互作有无。
对于内源性Co-IP实验，如果出现阴性结果，也有可能是蛋白在细胞内表达过低导致，这种情况也可以先做过表达Co-IP作为对照。只有设置了正确的对照，出来的结果才是可以被合理解释的，也是被认可的。
1、内源性Co-IP检测
对于Protein A/G微珠，一般会设置Input和同型对照：Input作为阳性对照，无需进行免疫沉淀步骤，直接使用制备好的样本进行检测，以证明靶蛋白存在于样本中；同型抗体作为阴性对照，使用同种属/类型的无关IgG进行IP，体现蛋白与IgG结合的背景信号，以排除假阳性结果。
上面示意图分为两大部分：IP 部分和 Input 部分。
首先看Input 部分，通过分别检测蛋白A和蛋白B表达水平可以确认：1组（IgG组）和2组（Anti-A组）中蛋白A、蛋白B均有表达，并且表达量一致，排除了因部分组别部分蛋白表达缺失、不同组蛋白表达量差异化大等原因造成的假阴性或者假阳性。
然后再看IP部分：“IB:A”结果显示1组（IgG组）不结合蛋白A ，2组（Anti-A组）可以特异性富集蛋白A。“IB:B”结果显示我们IgG组没有非特异性结合，Anti-A组通过特异性富集蛋白A进而拉下蛋白B，即提示我们蛋白A和蛋白B可形成复合物，存在互作。
也可以用另一种分组方式。其中IP组又分为IgG组（阴性对照组）和实验组，并通过WB去验证蛋白A和B在每一个组里面是否存在。
由Input组得到结论：蛋白A与蛋白B都是存在的，证明样本处理提取蛋白的步骤没有任何问题。这也提示：本实验一般是选取同一份细胞样品，提前取出部分做Input,其余均分为两份即IgG组（阴性对照组）和实验组。
IP部分：2组（IgG组）结果显示，蛋白A与蛋白B均没有条带，说明利用IgG抗体没有把蛋白A和B沉淀下来，证明蛋白A和B与IgG没有结合，同时排除了蛋白与抗体非特异性结合的可能性；而实验组蛋白A和B均有条带，表示利用蛋白A的抗体进行免疫沉淀，富集了蛋白A，同时蛋白B也被拉下来，即提示我们蛋白A和蛋白B可形成复合物，存在互作。
2、外源性Co-IP检测
针对标签蛋白的转染过表达的IP/Co-IP，其阴性对照一般选择未转染该标签细胞制备的lysate，以体现不含标签的蛋白与IP捕获抗体结合的背景信号，排除IP假阳性结果。
结果同样分为两大部分：IP 部分和 Input 部分。
首先看Input 部分，通过分别检测HA和Flag表达水平，我们可以确认：A-Flag和B-HA过表达后都能被检测到，并且表达量一致，排除了因样品量不均匀、样品组分缺失等原因造成的假阴性或者假阳性。
然后我们再看IP部分，“IB:Flag ”结果显示1、3组通过IP:Flag可以特异性识别Flag标签并富集蛋白A。“IB:HA”结果显示1、2对照两组没有捕获蛋白B，第3组通过特异性富集蛋白A进而捕获蛋白B，即提示我们蛋白A和蛋白B可形成复合物，存在互作。
WB检测抗体及抗体的选择
如捕获标签-融合蛋白，可以选用纳米抗体，即羊驼重链抗体可变区（VHH），使用普通二抗也可以避免轻重链干扰。
实验步骤
前期准备
在2个T75或者2个10cm皿内铺板293T，使用PEI转染质粒，等待2天；
Day1：收集、裂解细胞
预冷PBS、EP管，取冰若干；
提前配置蛋白裂解液：每组样本准备1000μL的RIPA（中）+10μL的PMSF（100×）/100μL的PPI（10×），置于冰上。
吸出两个瓶/皿中的培养液，加1mL预冷的1×PBS，再用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞转入预冷的EP管中，4℃，500G离心5min，弃去上清，用预冷的1X PBS重悬细胞，离心，弃上清，重复两次。
使用1000μL裂解液重悬细胞。
将EP管放于冰上30min，每隔10min重悬细胞一次。
摩天轮 4°C 转动 40-60min 以彻底裂解细胞（摩天轮上ep管可以用封口膜封口）；
将蛋白冻存于-80℃，或直接进行下一步；
Day2：平衡磁珠、结合蛋白
【康体FLAG磁珠】
取出蛋白，在冰上融化，12000G离心15min；
吸出50μL作为input，向其中加入12μL 5×SDS，混匀，置于-80℃；
配置1×PBST：1×PBS中加入0.05%的Tween20（50mL：25μL），配置完后置于冰上；
涡旋Anti-Flag Magarose Beads磁珠，吸取25μL置于1.5mL 无酶EP管中；
加入500μL 1XPBST（1X PBS+0.05%Tween-20），手动摇晃60s；
放入磁力架静置60s，吸去上清，再加入500μL 1XPBST，随后在4℃摩天轮转动5min；再次放入磁力架吸附，重复3次；
在平衡好的磁珠中加入细胞蛋白提取液，用封口膜封口后4℃摇床翻转过夜；
【Thermo FLAG磁珠】
准备工作：
打开95℃金属浴；
准备RIPA（中）、 5×SDS、1×PBS以及10×PPI，以及若干EP管，置于冰上；
取出蛋白样品，在冰上融化，12000G离心15min；
取出磁珠，使用前将磁珠平衡至室温；
离心期间平衡洗涤磁珠、标记无酶离心管：
配置含PPI的裂解液（Binding Buffer）：RIPA（中）加入十分之一体积的10× PPI（10mL：1mL），配置完后置于冰上；
涡旋或吹匀Anti-Flag Magnetic Agarose磁性琼脂糖珠，为每个样品吸取25μL（说明书推荐50μL）置于1.5mL 无酶EP管中；
每管加入500μL 上述配置的裂解液，手动摇晃60s混匀；
放入磁力架静置60s，吸去上清，加入500μL上述裂解液重悬，随后在4℃摩天轮转动5min；
再次放入磁力架吸附，弃上清，加入500μL裂解液，重悬洗涤5min，再磁力架吸附，弃去上清；
从离心完的蛋白样品上清中吸出50μL作为input，向其中加入12μL 5×SDS，混匀，95℃加热10min，置于-80℃；
其余样品加入到平衡好的磁珠管中，再加入10× PPI，用封口膜封口后4℃摇床翻转过夜；
【Thermo Protein A/G 磁珠】
准备工作：
提前打开95℃金属浴；
准备5× SDS以及若干EP管（蛋白上清若干管，input若干管，磁珠若干管）；
取出蛋白样品，在冰上融化，12000G离心15min；
从离心完的蛋白样品上清中吸出50μL作为input，向其中加入12μL 5×SDS，混匀，95℃加热10min，置于-80℃；
将其余蛋白上清分为2份，分别与约10μL的IgG同型对照抗体/目的蛋白抗体进行混合（每个T75的293T约1.2mg蛋白，抗体浓度一般1-5 µL/mg；2个T75的蛋白量即对应2-10μL抗体），4℃翻转过夜（若阴性对照有阳性结果，可以减少孵育时间至室温孵育1-2h）；
Day3：洗涤、洗脱
【康体FLAG磁珠】
用磁力架静置分离磁珠1min，吸去上清液；
加入500μL PBST悬浮磁珠，4℃冰箱旋转摇晃5min；再静置，如此重复洗涤4次；
配置30μL 1× SDS loading buffer，加入PMSF/PPI；
吸去上清液，用30μL 1×SDS loading重悬磁珠；
95℃加热磁珠10min，使免疫沉淀复合物与磁珠分离；
用磁力架静置分离磁珠，取上清，冻于-80℃，跑SDS-PAGE。
【Thermo FLAG磁珠】
准备工作：
提前打开95℃金属浴；
配置含PPI的1×PBS（Wash Buffer）：1×PBS中加入十分之一体积的10× PPI（10mL：1mL），配置完后置于冰上；
配置含PPI的ddH2O：ddH2O中加入十分之一体积的10× PPI（2mL：200μL），配置完后置于冰上；
配置1× SDS PAGE sample buffer：5×SDS+10×PPI用RIPA（中）稀释；
用磁力架分离磁珠，吸弃上清，加入500μL 配置好的Wash Buffer，混匀，磁力架分离。重复洗一遍；
加500μL 配置好的ddH2O，混匀洗涤1遍；
用磁力架分离磁珠，吸弃上清，加入50μL（说明书推荐100μL）1× SDS PAGE sample buffer，混匀；
95-100℃加热10分钟（期间标记EP管）；
用磁力架分离磁珠，吸取上清至新的EP管，-80℃保存。
【Thermo Protein A/G 磁珠】
准备工作：
配置Wash Buffer（含0.05% Tween20 的TBST）：2.5 mL TBS（20×）用47.5 mL ddH2O稀释，再加入25μL Tween20，混匀，置于冰上 【注：TBS一般含有0.15 mol/L NaCl, 为减少非特异性结合，可以将NaCl增至 0.5mol/L】；
配置含PPI的ddH2O：ddH2O中加入十分之一体积的10× PPI（2mL：200μL），配置完后置于冰上；
配置1× SDS PAGE：5×SDS+10×PPI用RIPA（中）稀释；
平衡洗涤磁珠：
准备若干无酶离心管，标记；
轻轻混匀磁珠悬液后，为每个样品吸取25μL至1.5mL无酶EP管中；
每管加入175μL Wash Buffer，轻柔摇晃60s混匀；
放入磁力架静置60s，吸去上清，加入1mL Wash Buffer，轻柔摇晃60s混匀；
磁力架静置混匀，吸去上清；
将抗体-蛋白混合物加入清洗完的磁珠中，4℃翻转孵育2-4h，或摩天轮摇床室温孵育1h；
用磁力架分离结合有蛋白的磁珠，吸弃上清，加入500μL 配置好的Wash Buffer，混匀，磁力架分离。重复洗2遍；
加500μL 配置好的ddH2O，混匀洗涤1遍；
用磁力架分离磁珠，吸弃上清，加入50μL（说明书推荐100μL）1× SDS PAGE sample buffer，混匀；
95℃加热10min；
孵育期间标记新的EP管（包含日期，细胞名，样品名等）；
用磁力架分离磁珠，吸取上清至新的EP管，-80℃保存。
【IP后的WB抗体选择】
如果IP和WB一抗来源（Host/Source）相同，IP后沉淀含有目的蛋白和IP抗体，在高温金属浴及还原剂的作用下，IP抗体发生发生变性，断裂为游离的重链（~50kDa）和轻链（~25kDa） 。后续做WB若使用前述的常规Anti-IgG(H+L)的酶标二抗，会同时识别原先的IP抗体和WB抗体，导致膜上至少出现三条不同的带。
解决方案一：WB一抗与IP一抗选择不同种属来源，此时选择普通二抗即可。
解决方案二：WB选用HRP偶联一抗，无需二抗。
解决方案三： 选用构象特异性或链型特异二抗，以避免重链和/或轻链的干扰。
构象特异性二抗，仅识别空间构象表位，高温变性的抗体失去了原有的空间构象，不会被识别，因此不会产生重链（~50kDa）和轻链（~25kDa）的条带。
当目标蛋白位于50kDa分子量附近时，可选择抗轻链的二抗，不识别重链，不会产生重链（~50kDa）的条带。
当目标蛋白位于25kDa分子量附近时，可选择抗重链端的二抗，不识别轻链，不会产生轻链（~25kDa）的条带。
Day4：银染
将一半的IP样本用于银染，另一半可用于IP-MS/Co-IP。
用10孔梳以及1.0mm的玻璃板，配10或12.5%的胶，每孔加适量的蛋白样本，两边加适量marker（marker用1×SDS，1：3稀释），电泳至条带彻底分开。
配置固定液（依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40ml Milli-Q级纯水，混匀后即成100ml固定液），将膜置于固定液中（干净的玻璃器皿/15cm皿）固定过夜。
【注：用15cm皿则上述固定液体积及以下所有溶液体积减半】
【注：银染时戴口罩手套，不能用手或金属接触胶，用干净的塑料镊子在边缘小心地挪动凝胶】
30%乙醇洗涤： 弃固定液，加入100ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。 30%乙醇的配制：70ml Milli-Q级纯水或双蒸水中加入30ml乙醇，混匀后即成100ml 30%乙醇。
水洗涤： 弃30%乙醇，加入200ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。如果本步骤用水洗涤更长时间，对降低染色的背景略有帮助。
增敏： 弃水，加入100ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm。 银染增敏液(1X)的配制：99ml Milli-Q级纯水或双蒸水中加入1ml银染增敏液(100X)，混匀后即为银染增敏液(1X)。银染增敏液(1X)配制后需在2小时内使用。
水洗涤(共2次)： 弃原有溶液，加入200ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。 弃水，再加入200ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。
银染： 弃水，加入100ml银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。 银溶液(1X)的配制：99ml Milli-Q级纯水或双蒸水中加入1ml银溶液(100X)，混匀后即为银溶液(1X)。银溶液(1X)配制后需在2小时内使用。
水洗涤： 弃原有溶液，加入100ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5分钟，摇动速度为60-70rpm。 注意：水洗涤的时间不能超过1-1.5分钟。
显色： 弃水，加入100ml银染显色液，在摇床上室温摇动3-10分钟，直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70rpm。 银染显色液的配制：80ml Milli-Q级纯水或双蒸水中加入20ml银染基本显色液(5X),再加入0.05ml银染显色加速液(2000X)，混匀后即为银染显色液。银染显色液配制后需在20分钟内使用。
终止： 弃银染显色液，加入100ml银染终止液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。终止时有气体产生属正常现象，产生的气体为二氧化碳。 银染终止液(1X)的配制：95ml Milli-Q级纯水或双蒸水中加入5ml银染终止液(20X),混匀后即为银染终止液(1X)。银染终止液(1X)配制后宜当天使用。
水洗涤： 弃银染终止液，加入100ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动2-5分钟，摇动速度为60-70rpm。
保存： 可在Milli-Q级纯水或双蒸水中保存。或采用适当的方式制备成干胶。
拍摄：
用手机或者Biorad显像系统（白色底板）拍摄银染图片。
IP-MS送样
配置1.0mm的10孔胶，每孔加25μL左右蛋白，左右加marker，每条泳道之间也用marker隔开；
电泳至下层胶1-2cm之内，切割胶条，置于EP管保存。
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