🧫脂质体转染(质粒/shRNA/RNP)

By Kaiyi Fu

质粒瞬转肿瘤细胞实验步骤

1、转染前一天

  • 铺板适量细胞,培养24h,直至70-90%融合;

  • 首次实验可以每组准备2个复孔,用不同lipo3000浓度进行转染;

2、转染当天(6孔板为例)

  • 预热培养基,将培养基更换为新鲜培养基;

  • 每孔准备2个EP管:

    • 管1:125μL Opti-MEM + 2.5 μg 质粒DNA + 5μL P3000(2μL/μg DNA,如果是siRNA不用加),混匀;

    • 管2:125μL Opti-MEM + 3.75/7.5μL lipo3000,混匀;

  • 向lipo3000所在EP管加入DNA,室温孵育15min;

  • 将DNA-lipo复合物加入细胞,可不换液;

对于6cm皿和10cm皿

6cm dish
10cm dish

Opti-MEM(每管)

250μL

750μL

Lipo 3000

7.5 or 15μL

22.5 or 45 μL

DNA

5μg

15μg

P3000

10μL

30μL

shRNA质粒瞬转实验步骤

shRNA质粒构建

序列设计:https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/semi-configurators/shrna?activeLink=productSearch

步骤:https://mp.weixin.qq.com/s/jPNGuPy7V0028yvwXwvJyw

质粒载体:BsmBI酶切位点

1、转染前一天

  • 接种2*10^5细胞/孔(MC38长得不快,可以加到5*10^5)于24孔板中,加入500μL含血清DMEM培养基,培养24h,至70-80%融合

  • 其他孔板的细胞密度见下表

2、转染当天(以24孔板为例)

  • 提前6-8h用Opti-MEM饥饿处理需要转染的细胞,以提升转染效率

  • 配置质粒溶液:取若干EP管,每管加50μL Opti-MEM培养基与1μg DNA(公司给的是500ng/μL,加2μL即可,可适量增大剂量),混匀。【注意分组:需要有空白组,NC,GAPDH,HPD的不同分组】

  • 配置转染试剂:取若干EP管,每管加入50μLOpti-MEM与2-5μL的Lipo2000,混匀,室温放置5min。

  • 另取离心管,将转染试剂滴加至shRNA质粒溶液中。轻柔混匀,室温放置20min。

  • 等待间隙,取10mL DMEM培养基37℃预热,在加转染试剂前吸掉原有培养基,用PBS洗一遍,加入400μL无血清DMEM培养基。

  • 将混合液加至含细胞与培养基的孔中,来回轻柔摇晃,充分混合。

  • 孵育4h,更换含血清培养基,去除复合物。

  • 细胞继续培养24-48h。过程中注意换液。

  • 所得细胞用于RNA抽提(24h)+RT-PCR以及Western Blot检测(48h)。

3、转染第二天

  • 在显微镜下统计表达绿色荧光的细胞,计算转染效率。

  • 收集细胞,进行qPCR以及WB,检测基因表达变化【24h检测RNA水平,48h后检测蛋白水平,中途只换液不传代】。

  • 选择抑制率最高的shRNA进行下一批实验。

CRISPR RNP瞬转实验步骤

  1. 在转染前 1 天,将细胞铺至 24 孔板中,1×10^5 个细胞/孔;

  2. 准备 2 个 1.5 mL 规格的 EP 离心管,标记为 A 和 B;

  3. A 管中加入:25 µL Opti-MEM TM (赛默飞)、36 pmol Cas9 蛋白(0.6μL*10mg/mL)、36 pmol EasyEdit sgRNA(0.4μL* 100 pmol/μL), 室温孵育 15 min;

  4. B 管中加入:25 µL Opti-MEMTM (赛默飞)、1.5 µL LipofectamineTM 2000 (赛默飞);

  5. 将 A 管和 B 管中的溶液轻柔的混合,并在室温下孵育 10 min;

  6. 将混合后的溶液加入 24 孔板中,50 µL/孔,将细胞置于 37℃培养箱中孵育;

  7. 72 h 后收集细胞,用于测序、INDEL 检测等后续操作。

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