# 重组蛋白原核表达

## 实验目的

蛋白纯化是指通过基因工程技术将编码蛋白的核酸序列导入到宿主细胞，使其大量表达，再使用适当的纯化方法将其在体外纯化出来，从而获得高纯度、活性和产量的蛋白质。蛋白质表达系统可以分为原核表达系统和真核表达系统两大类。

纯化后的蛋白可以用于GST-pull down以及其他实验。此教程原核表达蛋白主要用于<mark style="color:red;">体外酶活测试</mark>，在大肠杆菌中表达酪氨酸分解代谢酶，同时在LB培养基中添加酪氨酸，观察菌液颜色是否变化。菌液颜色变深提示尿黑酸的生成，颜色不变提示酶活功能丧失。（参考文献：HPD is an RNA-Binding Protein Sustaining Ovarian Cancer Cell Glycolysis, Tumor Growth, and Drug Resistance）

## 实验原理

* 原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列，且密集于染色体上，共同形成一个转录单位——操纵子，也称基因表达的协同单位。
* E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙酰基转移酶（transacetylase)；此外还有调控基因：操纵序列O(operator)、启动序列P(promoter)；而I(编码Lac阻遏物，Lac repressor)不属于乳糖操纵子。

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FDh7DQfcVWA3p8RBSXyEW%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=21a43025-4e11-4ad3-aa55-880733703675" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

* 在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态，此时，I序列表达Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录启动。

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FCApiIxp93ksKoQh9QGyB%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=1c07e50d-5db4-4611-b7a3-f611d41775a2" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

* 当有乳糖存在时，乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为异乳糖，异乳糖结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离，从而启动转录。<mark style="color:red;">异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）</mark>的作用与异乳糖相同，是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

<figure><img src="https://3583750438-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FrNJkPTdpyVMk09ldgu9A%2Fuploads%2FDujaZjwgypM3xHdBVAYO%2Fimage.png?alt=media&#x26;token=a1df7d93-274b-49b8-a543-a66718efe13f" alt=""><figcaption></figcaption></figure>

## 实验试剂

* LB肉汤培养基、LB平板、抗生素（Kan+,Amp+等）、诱导剂IPTG、金属离子CaCl2
* CaCl2作用：外源蛋白二硫键的形成是一个酶依赖性反应过程，向培养基中添加适量的金属离子，可能提高这些酶类的活性，因此也能增加可溶蛋白的表达量。某些外源蛋白的活性和稳定性与某些金属离子密切相关，因此向培养基中添加外源蛋白所需金属离子也可能提高蛋白的可溶性和稳定性。
* Kana工作浓度：<mark style="color:red;">50μg/mL</mark>；如果是10mg/mL的即用型溶液，按1：200稀释，即每200mL加1mL
* IPTG贮存液：2g溶于10mL ddH2O，0.22μm滤膜过滤，分装至1mL（浓度200mg/mL），冻于-20℃

## 实验步骤

### 1、构建原核表达质粒：

* 采用pET-28a(+)质粒：T7启动子，卡那霉素抗性基因（KanR），His标签，常用于在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。
* 目的基因PCR，载体酶切，连接，转化，挑单克隆送测序，提取质粒

### 2、转化

* 拿到质粒，离心（3000r/min；2min)
* 在质粒中加入TE buffer或ddH2O，一般为1μg质粒加20μL TE；2μg质粒加50μL TE；5μg质粒加100μL TE
* 将质粒与TE混匀，吸取2μL混液与BL21(DE3)感受态细胞混匀
* 将感受态细胞置于冰上30min
* 取出后立即放入水浴锅中（42℃），热激90s,
* 再次置于冰上，2min
* 拿出后取200μL的LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中
* 放入摇床（37℃;  195r) 中,  30nim至60min; (最佳45min)
* 取出离心（3000r/min；2min)
* 去掉200μL的上清，留100μL左右上清悬浮沉淀，吸取50μL悬液涂平板，【先将对应抗性的平板放入培养箱（37℃）中预热20min】
* 把平板放入培养箱（37℃），过夜（12h至16h）

### 3、小摇

* 每个平板挑取单菌落至4支<mark style="color:red;">对应抗性</mark>的LB（5mL）离心管中，编号
* 将离心管放入摇床（37℃；220rpm) 中过夜

### 4、表达

* 从各离心管中吸取10μL菌液，添加至新的15mL离心管中（5mL LB，同时添加酪氨酸用于体外酶活实验），37℃表达3.5h（OD600到达0.5\~0.7区间）
* 在每组菌管中分别加入25μL的200mg/mL的IPTG贮存液（终浓度1mg/mL）

{% hint style="info" %}
酪氨酸配置：溶于HCl，

IPTG配置：1g IPTG溶于5mL ddH2O，0.22um滤器过滤，分装，得到200mg/mL贮存液
{% endhint %}

* 在16°C下以160 rpm的速度振荡培养8小时，然后在37°C、220 rpm下继续振荡过夜
* 收集细菌液体的上清液，并在405nm波长下测量吸光度值