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# 肿瘤球+3D侵袭+克隆形成

## 3D肿瘤球生长/侵袭实验步骤

* 可以选用低吸附的Corning 96孔U型板，也可以用碧云天包被液提前将普通96孔U型板包被；
* 包被步骤：
  * 在超净工作台或生物安全柜内，向U形底96孔板每孔加入40μl包被液。注：加液时需避免出现气泡。&#x20;
  * 盖上U形底96孔板盖子，放入二氧化碳培养箱静置至少10分钟。注：延长静置时间，效果会更佳，例如将包被液置于培养箱过夜直至孔板中的液体完全挥发。
  * 取出培养板，小心吸去包被液，避免触及底部包被区（可以将96孔板倾斜，枪头抵住圆底侧壁吸液）。&#x20;
  * 培养板在超净工作台内继续静置干燥至少10分钟（可以开盖加快干燥速度），然后进行细胞接种。注：延长静置干燥时间，效果会更佳。
* 消化肿瘤细胞并计数，将细胞悬液浓度调整至<mark style="color:red;">**2-5×10^4cells/mL**</mark>，备用；
* 取2000-5000个细胞，打入圆底96孔板（确保已经板底已经干燥，贴壁轻轻加细胞）；
* 125G离心10min；
* 置于培养箱培养7天；
* 如观察侵袭，在第3天向培养基中加入Matrgel基质胶（100μL培养基加入50μL），观察侵袭表型。

## 肿瘤球形成实验：表征肿瘤干性

参考文献：Organoid modelling identifies that DACH1 functions as a tumour promoter in colorectal cancer by modulating BMP signalling；SIRT6 Suppresses Pancreatic Cancer through Control of Lin28b

* 消化HCT116细胞，用PBS洗涤两次，并计数。将500个细胞铺在低吸附96孔板中，该孔板含有200毫升无血清Sphere formation medium；
* Sphere formation medium配比：
  * DMEM/F12；
  * 0.2%（20μM/mL） B27 (Thermo Fisher Scientific)；
  * 10或20 ng/mL 表皮生长因子recombinant EGF (Sino Biological Inc.) ；
  * 10或20 ng/mL 碱性成纤维生长因子bFGF (PeproTech China, Jiangsu, China) 。
* 每3天加入100μL培养基；
* 十天后，拍照并计算肿瘤球形成的数量。

## 3D侵袭实验步骤

* 提前取出-20℃保存的基质胶（Matrigel, Corning），在4℃解冻，随后置于冰上；
* 期间消化肿瘤细胞并计数；
* 取200μL基质胶+200μL鼠尾胶原I（Rat tail collagen I, Corning），混匀后立即加入<mark style="color:red;">1×10^5</mark>个MC38细胞，吹打混匀，加至共聚焦小皿底部中央；
* 凝固后在基质胶上加200μL培养基，置于培养箱培养；
* 如细胞带有荧光，48-72h后，吸去培养基，用PBS洗涤一次，用聚焦拍照；
* 如不同组的细胞增殖速度改变（可以用丝裂霉素（Mitomycin）或者放线菌酮（Cycloheximide）处理细胞，排除细胞增殖对结果的干扰）；
* 如细胞没有荧光，可以加入500μL 37℃提前预热的活细胞染料（Calcein green，CellTrace Red CMTPX等），避光孵育30-60min，PBS充分洗涤后用共聚焦拍照，594nm波长处观察。

## 平板克隆形成

* 将细胞消化，稀释成1000-3000个细胞/mL，加入6孔板；
* 2周后弃去培养基，4%甲醛固定20min，结晶紫染色，自来水轻轻洗涤，晾干后在背光板拍照观察。

## 软琼脂集落形成（Soft agar assay）

又称为非锚定依赖性生长实验（Anehorage independent assay）

（1）配置琼脂：提前配置1.2%和0.7%琼脂（低熔点Agarose 加蒸馏水配置），高压灭菌后4摄氏度冰箱保存。铺板当天微波炉或烘箱加热融化，提前置于37摄氏度培养箱/烘箱中，为避免反复加热失效，建议分装。

（2）配置2×培养基：提前配置含20%FBS和2%双抗的相应细胞的培养基，37℃预热。

（3）铺下层胶：根据铺板孔数，按1：1比例混匀1.2%Agarose和预热后的2×培养基，6孔板每孔加2毫升混合液（吸二打一，尽量不要吹入气泡），摇匀6孔板，在室温条件下等待冷却凝固。

（4）制备细胞悬液：将对数生长期的单层细胞常规消化离心收集细胞沉淀。重悬细胞沉淀，计数，倍比稀释至5×10^3-5×10^4个/mL（如5\*10^5 → 5\*10^4 → 5\*10^3/mL）。

（5）铺上层胶：根据铺板数量，按1：1比例使0.7%Agarose和预热后的2×培养基混匀，每组取6毫升混合液于15mL管中（每组3个孔），分别向管中加入300微升细胞悬液（每孔500个，数量可调整），充分混匀后加入已铺下层胶的6孔板中（旋转贴壁加），待上层琼脂凝固后，<mark style="color:red;">在上方加200μL培养基</mark>。放在37摄氏度培养箱中培养2-3周，每三天向孔板中加入200微升培养基。

（6）观察：以肉眼可见的细胞团作为计数集落的标准，计算集落形成率；显微镜下拍照，统计克隆直径；或用结晶紫染色，统计集落个数。

注：

1. 细胞一定要吹打分散成单细胞悬液；
2. 铺板操作时速度要快，以免造成局部凝固；
3. 第一次实验最好设置细胞接种梯度，如500-1000-2000-5000个/孔挑选出最合适的接种密度
4. 最后铺上一层培养基是为了防止胶干燥，并给细胞补充营养，如果做药物处理，则在培养基中加入药物；
5. 单个克隆细胞数到达50个左右即可固定细胞；


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