🚰流式细胞术+流式分选
基本原理
实验试剂
根据设计的panel，提前准备流式抗体（检查余量是否充足）
准备Fc Block（注意种属）、Perm、IC fixation、PBS等
实验设备
Beckman CytoFLEX
BD FACSymphony A1
610/20通道为mCherry
实验步骤
对于组织消化得到的样本，具体见“小鼠肿瘤单细胞悬液制备部分”，下为体外培养细胞样本。
表染+胞染：
1、消化细胞：从培养箱取出细胞（5*10^5-1*10^6个细胞），用胰酶（覆盖住细胞即可）消化2min，直至大块细胞脱落，用含10%的FBS的DMEM终止消化。将孔板中的细胞悬液加入到流式管中，并用PBS洗涤、定容至2mL；
2、离心洗涤：将流式管放入离心机 500g 5min 离心，弃去上清，弹匀细胞。再加2毫升PBS洗涤。再离心。弃去上清，再弹匀重悬细胞；
3、抗原封闭：
小鼠细胞：染色前，每50uL 细胞标本加入0.5μL 抗小鼠CD16/ CD32抗体，在4°C 温度下预先孵育细胞10-20 分钟。
人细胞：染色前，每50uL 细胞标本加入0.5-1 μL人Fc 受体结合抑制剂， 在4°C 温度下预先孵育细胞10-20 分钟。
4、样本管标记（等待期间）：
准备好单染管、空白管、FMO管、样本管等（单染管上标记好所染的marker及其标记的荧光分子、以及活死，空白管上标Blank）；
每管取7~8uL的悬液于空白管中并补充100uL的PBS
5、将空白管中的悬液平均分到单染管中，空白管中也要剩。
6、配置表染抗体：根据抗体效价，在EP管内吸取并稀释抗体（按每管50微升PBS，0.5微升抗体（Live/Dead 0.2μL）配置抗体溶液），涡旋混匀。
7、抗体表染：涡旋混匀，4℃冰箱避光放置30min。
活死（PB）
-
+
+
+
固有GFP（FITC）
-
GFP+
+
兔抗鼠二抗（APC）
-
+
+
+
碘化丙啶PI（PE通道）
-
8、洗涤抗体：孵育结束后每管加入2mL的PBS，500g，离心5min。
9、破膜固定：
弃去上清，弹匀。
如穿膜：每管加入IC fixation 100uL，室温避光放置20-60min。
如穿核：每管加穿核液1mL（Fix/Perm Concentrate小黑瓶：Fix Perm Diluent大白瓶=1：3），室温避光放置20-60min。
如染细胞周期（染PI碘化丙啶）：加入75%乙醇1mL，固定30min。
固定期间，用ddH2O和10X Perm溶液配置1X perm溶液。
加入1X perm溶液1-2mL，离心（500g，5min），弃上清，用残余液体重悬细胞。
重复用1X perm洗一次。
10、配置胞染抗体：在离心同时用1×perm溶液配制胞内抗体（0.5微升抗体/50微升Perm每管）。
11、胞染：离心完后，每管加20微升抗体perm溶液，涡旋混匀，室温下染色40分钟。
12、洗涤胞染抗体：
用1mL Perm洗涤，离心（500g，5min）。弃去上清，弹匀。
重复洗涤一次
13、添加二抗：加1X Perm溶解的0.5微升二抗（如duncky抗rabbit，488），避光孵育30min。
14、洗涤二抗：
用1mL Perm洗涤，离心（500g，5min）。弃去上清，弹匀。
重复洗涤一次
15、每管加入200-400微升PBS，重悬细胞。避光保存在4度冰箱中，用于后续流式分析。
上机操作（Beckman CytoFLEX）：
1.检查鞘液是否充足、废液是否排空
2.开机：打开仪器后面的电源开关，进入流式软件,在细胞仪菜单下选择开机流程，并在样本架上放置盛有2mLdd水的流式管用于后续开机过程，点击初始化-开始。
3.建立实验：
结束后点击新建实验，命名实验名称后保存于D盘Data文件夹中；
在设置菜单打开设置通道，选取相应的通道并标注对应的marker；
在快捷工具栏创建点图（第4个图标）和直方图（第3个图标），并点击标题设置圈门逻辑
一般第一个图横纵坐标为FSC-A和SSC-A，用于大体确定所要观察的细胞亚群；
第二个图为FSC-H和FSC-A，用于消除粘连体
第三个图为L/D，圈选活细胞
4.调电压增益：
将空白对照的Blank管放入样品架，并设置好功能区的采集个数、显示个数和记录时间、采样速度等；
点击左上角“采样参数设置”可以调节各通道的电压增益，或者使用写有字母“G”的增益调节手型工具（点住需要调整的图形上的目的细胞群不放，拖拽至认为合适的位置，松开鼠标，即自动保存）保证直方图中阴性群体处于左侧合适位置【小于10^4】
点击“运行”进行动态调节；
5.调补偿：
将一单染管放入样品架中，点击左下角“试管”菜单下的最左侧按钮新建试管，并命名为对应单染的荧光分子与marker；
在新建的点图中更改x轴为单染的荧光分子，而y轴则分别改为其他的荧光分子信号；
点击“运行”，使用补偿矩阵或者有字母“C”的补偿手型工具（点住需要调整的图形上的目的细胞群不放，拖拽至认为合适的位置，松开鼠标，即自动保存）调节该单染荧光分子通道中其他荧光分子的信号至阴性（水平），依次调节每个荧光分子的通道，直至“横平竖直”
6.分析样本：
放入加有200uLPBS的待测样本，添加点图并更改逻辑，第三个图为CD3信号和SSC-A，合理圈门以确定T细胞；第四个点图为CD8信号，用以确定CD8+T细胞；第五个点图为CD4信号，用以确定CD4+T细胞，而后续的点图则根据要测的marker来选择，并确定好marker的阳性群所在门（可根据空白管进行确定）；
选择好收集细胞的数量后点击“记录”，收集数据，并在结束后创建新试管
利用bar工具可以进行图形的优化（拖动坐标轴）；
点击右键可以设置门的任意名称与颜色；
标题里第5个图标为统计结果列表，右键可设置需要显示的统计结果数值；
7.关机清洗：
细胞仪菜单里选择每日清晰，放入装有dd水的流式管，设置执行时间为5min；
倒掉废液
【注意】
需要根据实际调整点图x轴和y轴所显示的最大细胞数量，一般为10^6个
样本管加入PBS后涡旋混匀
样本管记录结束后放回抽屉避光保存
上机操作（BD FACSymphony A1）：
打开鞘液桶，用1×PBS补足鞘液；
打开流式电源开关，StandBy模式静置10分钟，待机器预热；
用流式管接一管ddH2O，点击PRIME排气泡；检查连接器是否有气泡，如有按住按钮排出；
打开BD FACS软件，在自己的文件夹下新建一个日期的文件夹，新建实验，新建样品管，选中前面的小三角（直至变绿）；
参数选择：
散射光FSC和SSC需要勾选H，但不勾选log；
荧光参数用对数log；
新建散点图圈门
x：FSC_A；y：SSC_A
x：FCS_A；y：FCS_H
右键点击“show population hierarchy”显示圈门逻辑关系；
低速上样，调整电压与补偿，将阴性群调至10^3以下，阳性群不超过10^5，点击“restart”刷新；
点击Record data记录数据，点击next tube；
实验结束后，用3mL 10× clean液高速跑5min，再用5mL ddH2O高速运行10分钟，关闭电源（关闭时吸样针需要浸在ddH2O中）；
倒空塑料桶中废液；
上机操作（Sony MA900流式分选）：
提前一天：最好提前一天添加鞘液，以消除鞘液中的气泡；准备高温灭菌的ddH2O，用于添加DI water；
鞘液配置方式：鞘液用500mL 10X PBS + 4500 mL 高温灭菌后的ddH2O（或怡宝纯净水），用Milli-Q直接过滤的ddH2O可能会导致较多气泡；
鞘液添加方式：
先断开白色气管，再断蓝色液流管，短接；
拉起拉环，提起桶盖向下按，旋转90度取出盖子，装满1×PBS；
双手提起桶盖旋转90度，均匀密封盖好；
先连接液管，再连接气管；
开机前检查：
移出液桶装置，固定锁扣，检查鞘液桶、纯水桶与废水桶，倒掉废液，添加鞘液和DI water，注意管路已正确连接；
液桶装置归位，固定锁扣；
检查电极板：在分选接收仓内有两块黑色挡板，逆时针旋开螺丝，擦拭表面结晶并擦干后归位；
清洁镜头（不必须，在工程师指导下进行）：逆时针小心拧开白色盖板上面的2个螺丝，轻轻拉出后，90度向外轻轻拉开旋转装置，拧开螺丝后取出外侧金属块，用ddH2O浸泡金属块再用无尘纸擦干，并用棉签蘸取少量ddH2O从内到外轻轻擦拭内外两个镜头，再用无尘纸擦干。归位。
注意：每次开机前若补充了鞘液或者纯水，均需要进行排气泡步骤；
打开空气压缩机；
拉开通风橱，点击On，点亮“插座”，打开通风，按power键开启分选仪主机；
打开软件，账号：user1，密码：password1；
弹出老的芯片，再取一新的芯片，面对电脑摄像头扫码，（如用旧芯片需要先更改电脑日期至芯片日期1d前后，再扫描芯片二维码），点击“push open”，插入芯片；
液滴校准：
勾选488激光，等待3-4分钟，观察液体是否滴落（dripping），如无液滴则需点击sample line cleaning 冲洗上样针；
液流启动检查(Fluidics check)：检查液滴是否稳定，若不稳定需要点击sheath filter debubble排气泡；
从4℃冰箱取出校准微球（黑色瓶），整瓶摇匀后滴加15滴至流式管内（淡蓝色），vortex，放入上样仓；
取出收集管适配器，依次完成光路校准(Chip Alignment)/激光延迟校准(Laser delay)、液滴断点计 算(Droplet Calibration)、侧液流偏转(Side Stream Calibration)和液滴延迟计算(Sort Delay Calibration)共 4 个步骤，约需 20-30 min；
设置实验信息：
进入控制软件界面，左侧面板建立新实验，编辑实验名称；
右侧面板勾选所有激光通道以及命名对应染料以及抗体名称；
圈门：
点击New DotPlot生成点图，双击建立新的圈门，再双击圈门进行子圈门；
右击荧光通道坐标轴，可以选择Bioexponential展示负轴；
调电压：
上样Blank管，点击Start开始上样，通过Detector & Threshold Settings调整电压；
修改电压后点击restart可以重新覆盖原有记录，再点击Record开始记录；
调补偿：根据单染管，可以手动调整或者用补偿矩阵进行调节；
调整完电压和补偿后可以开始分选：
点击开门按钮，将回收管（15mL离心管或流式管）以及对应适配器置于回收仓内；
点击下方的Sort Control-Unload Collection，设置Sort-Gate与Stop Count，点击Sort Start & Record即开始分选；Sample Pressure建议在4-6之间；
点击Cytometer，点击Collection 5℃和Sample 5℃，以保持细胞活性；
点击黑色的Stop以及Next Tube，重新上样品管和收集管，开始下一管的分选；
右键某个样本管，点击Assign可以指定样本管开始分选；
Standby：Cytometer - Cytometer settings - advanced settings - Pressure Options - Stand By
关机流程（Sony）：
点击软件菜单“Cytometer”下的“Hardware and Software Shutdown”。
准备10mL Bleach溶液（15mL离心管装，2ml 0.5%84消毒液+8ml H2O）和12mL去离子水（15mL离心管装），按照软件向导提示进行操作，勾选Normal Cleaning选项，依次用次氯酸钠溶液和无菌去离子水上样冲洗管路（均选用normal cleaning）。
完成冲洗后点击“shutdown”仪器和软件均自动关闭。 关闭电脑和空气压缩机电源。
参考文件：
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