流式细胞术+流式分选
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1、消化细胞：从培养箱取出细胞（5*10^5-1*10^6个细胞），用胰酶（覆盖住细胞即可）消化2min，直至大块细胞脱落，用含10%的FBS的DMEM终止消化。将孔板中的细胞悬液加入到流式管中，并用PBS洗涤、定容至2mL；
2、离心洗涤：将流式管放入离心机 500g 5min 离心，弃去上清，弹匀细胞。再加2毫升PBS洗涤。再离心。弃去上清，再弹匀重悬细胞；
3、抗原封闭：
小鼠细胞：染色前，每50uL 细胞标本加入0.5μL 抗小鼠CD16/ CD32抗体，在4°C 温度下预先孵育细胞10-20 分钟。
人细胞：染色前，每50uL 细胞标本加入0.5-1 μL人Fc 受体结合抑制剂， 在4°C 温度下预先孵育细胞10-20 分钟。
4、样本管标记（等待期间）：
准备好单染管、空白管、FMO管、样本管等（单染管上标记好所染的marker及其标记的荧光分子、以及活死，空白管上标Blank）；
每管取7~8uL的悬液于空白管中并补充100uL的PBS
5、将空白管中的悬液平均分到单染管中，空白管中也要剩。
6、配置表染抗体：根据抗体效价，在EP管内吸取并稀释抗体（按每管50微升PBS，0.5微升抗体（Live/Dead 0.2μL）配置抗体溶液），涡旋混匀。
7、抗体表染：涡旋混匀，4℃冰箱避光放置30min。
活死（PB）
-
+
+
+
固有GFP（FITC）
-
GFP+
+
兔抗鼠二抗（APC）
-
+
+
+
碘化丙啶PI（PE通道）
-
8、洗涤抗体：孵育结束后每管加入2mL的PBS，500g，离心5min。
9、破膜固定：
弃去上清，弹匀。
如穿膜：每管加入IC fixation100uL，室温避光放置20-60min。
如穿核：每管加穿核液1mL（Fix/Perm Concentrate小黑瓶：Fix Perm Diluent大白瓶=1：3），室温避光放置20-60min。
如染细胞周期（染PI碘化丙啶）：加入75%乙醇1mL，固定30min。
固定期间，用ddH2O和10X Perm溶液配置1X perm溶液。
加入1X perm溶液1-2mL，离心（500g，5min），弃上清，用残余液体重悬细胞。
重复用1X perm洗一次。
10、配置胞染抗体：在离心同时用perm溶液配制胞内抗体（0.5微升抗体/50微升Perm每管）。
11、胞染：离心完后，每管加20微升抗体perm溶液，涡旋混匀，室温下染色40分钟。
12、洗涤胞染抗体：
用1mL Perm洗涤，离心（500g，5min）。弃去上清，弹匀。
重复洗涤一次
13、添加二抗：加1X Perm溶解的0.5微升二抗（如duncky抗rabbit，488），避光孵育30min。
14、洗涤二抗：
用1mL Perm洗涤，离心（500g，5min）。弃去上清，弹匀。
重复洗涤一次
15、每管加入200-400微升PBS，重悬细胞。避光保存在4度冰箱中，用于后续流式分析。
1.检查鞘液是否充足、废液是否排空
2.开机：打开仪器电源，进入流式软件,在细胞仪菜单下选择开机流程，并在样本架上放置盛有2mLdd水的流式管用于后续开机过程
3.建立实验：结束后点击新建实验，命名实验名称后保存于D盘Data文件夹中；在设置菜单打开设置通道，选取相应的通道并标注对应的marker；在快捷工具栏创建点图并点击标题设置逻辑（一般第一个图为FSC-A和SSC-A，用于大体确定所要观察的白细胞亚群；第二个图为FSC-H和FSC-A，用于消除粘连体）和直方图
4.调电压：将空白对照的Blank管放入样品架，并设置好功能区的采集个数、显示个数和记录时间、采样速度等；点击左侧采样参数设置可以调节各通道的电压增益，保证直方图中阴性群体处于左侧合适位置【小于10^4】。点击运行进行动态调节
5.调补偿：将一单染管放入样品架中，点击左侧试管菜单下的最左侧按钮新建试管，并命名为对应单染的荧光分子与marker；在新建的点图中更改x轴为单染的荧光分子，而y轴则分别改为其他的荧光分子信号；点击运行，使用补偿矩阵或者补偿手型工具调节该单染荧光分子通道中其他荧光分子的信号至阴性（水平）。依次调节每个荧光分子的通道
6.分析样本：放入加有200uLPBS的待测样本，添加点图并更改逻辑，第三个图为CD3信号和SSC-A，合理圈门以确定T细胞；第四个点图为CD8信号，用以确定CD8+T细胞；第五个点图为CD4信号，用以确定CD4+T细胞，而后续的点图则根据要测的marker来选择，并确定好marker的阳性群所在门（可根据空白管进行确定）；选择好收集细胞的数量后点击记录，收集数据，并在结束后创建新试管
7.关机清洗：细胞仪菜单里选择每日清晰，放入装有dd水的流式管，设置执行时间为5min；倒掉废液
【注意】
1.需要根据实际调整点图x轴和y轴所显示的最大细胞数量，一般为10^6个
2.样本管加入PBS后涡旋混匀
3.样本管记录结束后放回抽屉避光保存
打开鞘液桶、纯水桶与废水桶，检查鞘液、DI water与废液：鞘液用500mL 10X PBS+4500 mL ddH2O配置，注意管路连接；DI water用高温灭菌过的ddH2O；开机前倒掉废液；
打开空气压缩机；
拉开通风橱，点击On，点亮“插座”，打开通风，按power键开启分选仪主机；
打开软件，账号：user1，密码：password1；
弹出老的芯片，再取一新的芯片，面对电脑摄像头扫码，（如用旧芯片需要先更改电脑日期至芯片日期1d前后，再扫描芯片二维码），点击“push open”，插入芯片；
从4℃冰箱取出校准微球（黑色瓶），整瓶摇匀后滴加至流式管内（淡蓝色），vortex，放入上样仓，自动校正15-20min；
进入控制软件界面，左侧面板建立新实验，编辑实验名称，右侧面板输入激光通道以及对应染料以及抗体名称；
点击New DotPlot生成点图，双击建立新的圈门，再双击圈门进行子圈门；
上样Blank管，点击Start开始上样，通过Detector & Threshold Settings调整电压，修改电压后点击restart可以重新覆盖原有记录，再点击Record开始记录；
调补偿：
调整完电压和补偿后可以开始分选：点击开门按钮，将回收管（15mL离心管）置于回收仓内，点击下方的Sort Control-Unload Collection，设置Sort-Gate与Stop Count，点击Sort Start & Record即开始分选；Sample Pressure建议在4-6之间；
点击Cytometer，点击Collection 5℃和Sample 5℃，以保持细胞活性；
点击黑色的Stop以及Next Tube，重新上样品管和收集管，开始下一管的分选。
Standby：Cytometer - Cytometer settings - advanced settings - Pressure Options - Stand By
点击软件菜单“Cytometer”下的“Hardware and Software Shutdown”。
准备10mL Bleach溶液（15mL离心管装，2ml 0.5%84消毒液+8ml H2O）和12mL去离子水（15mL离心管装），按照软件向导提示进行操作，勾选Normal Cleaning选项，依次用次氯酸钠溶液和无菌去离子水上样冲洗管路。
完成冲洗后点击“shutdown”仪器和软件均自动关闭。 关闭电脑和空气压缩机电源。
参考文件：
