🌟CCK-8细胞增殖毒性

实验原理：

• 在CCK-8试剂盒中，最主要的化学药品是WST-8，化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐。在电子耦合试剂（也就是细胞是活的，有呼吸，有能量代谢）存在的情况下，可被NAD+氧化还原成为水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan)。活细胞越多，产生的Formazan就越多，颜色也会越深。

• 所以粗略的可以认为生成的甲瓒物的颜色的深浅与活细胞的数量成正比。但是这里没有考虑到细胞代谢水平的高低，有些细胞在药物处理后，可能活细胞数不变，但是代谢率低了以后，细胞呼吸减弱，NAD+产生减少，测出的Formazan也会减少。

分组情况：

使用96孔板，分为若干组（实验组，对照组、空白组），每组5个复孔（数据差异大时可以去除最大、最小值，再取平均）

实验孔：5x10^3实验组细胞+100μL DEME培养基+10uL CCK-8 溶液+（相应浓度的药物/试剂）

对照孔：5x10^3对照组细胞+100μL DEME培养基+10uL CCK-8 溶液

空白孔：100μL DEME培养基+10uL CCK-8 溶液

细胞增殖实验步骤：

1. 细胞悬液制备：取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液（可在12孔板内配置），通常细胞增殖实验每孔加入约1×10³-5×10³个细胞/100ul（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）；

2. 接种细胞悬液：在96孔板接种细胞悬液，可做多个实验组，每组设置3-6个复孔，同时设置空白组，然后将细胞置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中培养5 day；

3. 加入CCK-8：两种方法，每孔直接加入10ul的CCK-8溶液,或者配置成含10% CCK-8溶液的培养基以换液的形式加入,注意加入过程中避免产生气泡，可以将枪头浸入培养液中缓慢加入，将加完CCK-8的培养板放入37°C 5% CO2 培养箱中孵育0.5-4h；

4. 测OD值：将96孔板取出，酶标仪检测各孔在450nm波长处的OD值，分析处理数据，绘制增殖曲线。阴性对照孔OD值在0.18-0.40之间，阳性对照孔最大在1.8-2.2之间最佳。

细胞毒性/增殖实验步骤：

前期准备：试剂稀释

1、尼替西农（NTBC, from MCE）：原始浓度为10mM in DMSO

• 160 μM组：1：50稀释，即1.6 μL NTBC + 100 μL 培养基（96孔板）；

• 80 μM组：1：125稀释，即0.8 μL NTBC + 100 μL 培养基（96孔板）；

• 40 μM组：1：250稀释，即0.4 μL NTBC + 100 μL 培养基（96孔板）；

• 20 μM组：1：500稀释，即4 μL NTBC + 16 μL PBS稀释，再加 1μL稀释液至 100μL 培养基（96孔板）；

• 10 μM组：1：1000稀释，即2 μL NTBC + 18 μL PBS稀释，再加 1μL稀释液至 100μL 培养基（96孔板）；

• 5 μM组：1：2000稀释，即1 μL NTBC +19 μL PBS稀释，再加 1μL稀释液至 100μL 培养基（96孔板）；

• 空白组：不加任何NTBC；

• DMSO对照（一般建议DMSO终浓度在 0.1% 以下）：取各组DMSO浓度平均值，即每100μL培养基加0.53μL MDSO；

2、尿黑酸（HGA，from MCE）

Day1：铺板

1、细胞铺板

• 比较MC38-GFP/MC38-OE/MC38-mMut细胞的增殖能力

  • 在12孔板中加入1.5×10^5个MC38-GFP/MC38-mMut细胞，用培养基补足至3mL，充分混匀。

  • 在12孔板中加入7.5×10^5个MC38-OE细胞，用培养基补足至3mL，充分混匀。

  • 用100μL排枪铺96孔（吸2打1），间歇混匀。

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
	PBS	PBS	PBS	PBS	PBS	PBS	PBS	PBS	PBS	PBS	PBS
Day1	PBS	MC38-GFP	MC38-GFP	MC38-GFP	MC38-OE	MC38-OE	MC38-OE	MC38-mMut	MC38-mMut	MC38-mMut	PBS
Day2	PBS	MC38-GFP	MC38-GFP	MC38-GFP	MC38-OE	MC38-OE	MC38-OE	MC38-mMut	MC38-mMut	MC38-mMut	PBS
Day3	PBS	MC38-GFP	MC38-GFP	MC38-GFP	MC38-OE	MC38-OE	MC38-OE	MC38-mMut	MC38-mMut	MC38-mMut	PBS
Day4	PBS	MC38-GFP	MC38-GFP	MC38-GFP	MC38-OE	MC38-OE	MC38-OE	MC38-mMut	MC38-mMut	MC38-mMut	PBS
Day5	PBS	MC38-GFP	MC38-GFP	MC38-GFP	MC38-OE	MC38-OE	MC38-OE	MC38-mMut	MC38-mMut	MC38-mMut	PBS
											PBS

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Day1	OE+160μM	OE+160μM	OE+160μM	OE+80μM	OE+80μM	OE+80μM	OE+40μM	OE+40μM	OE+40μM	OE+20μM	OE+20μM	OE+20μM
Day2	OE+160μM	OE+160μM	OE+160μM	OE+80μM	OE+80μM	OE+80μM	OE+40μM	OE+40μM	OE+40μM	OE+20μM	OE+20μM	OE+20μM
Day3	OE+160μM	OE+160μM	OE+160μM	OE+80μM	OE+80μM	OE+80μM	OE+40μM	OE+40μM	OE+40μM	OE+20μM	OE+20μM	OE+20μM
Day4	OE+160μM	OE+160μM	OE+160μM	OE+80μM	OE+80μM	OE+80μM	OE+40μM	OE+40μM	OE+40μM	OE+20μM	OE+20μM	OE+20μM
Day1	OE+10μM	OE+10μM	OE+10μM	OE+5μM	OE+5μM	OE+5μM	+0.53μL DMSO	+0.53μL DMSO	+0.53μL DMSO	MC38-OE	MC38-OE	MC38-OE
Day2	OE+10μM	OE+10μM	OE+10μM	OE+5μM	OE+5μM	OE+5μM	+0.53μL DMSO	+0.53μL DMSO	+0.53μL DMSO	MC38-OE	MC38-OE	MC38-OE
Day3	OE+10μM	OE+10μM	OE+10μM	OE+5μM	OE+5μM	OE+5μM	+0.53μL DMSO	+0.53μL DMSO	+0.53μL DMSO	MC38-OE	MC38-OE	MC38-OE
Day4	OE+10μM	OE+10μM	OE+10μM	OE+5μM	OE+5μM	OE+5μM	+0.53μL DMSO	+0.53μL DMSO	+0.53μL DMSO	MC38-OE	MC38-OE	MC38-OE

2、4-24h后，在MC38-OE细胞中加入不同浓度的NTBC/DMSO，观察NTBC对细胞的抑制作用。

3、37℃培养箱中培养，每隔24h测量一次OD值。

4、每次测量OD值时，先用100μL排枪吸去原有培养基，再每孔加入100μL 经1：10稀释的CCK-8溶液。向空白孔中也加入100μL稀释后的CCK-8溶液。【注意吸2打1，不要在孔洞中引入气泡，否则可能会干扰O.D.读数】

5、将96孔板置于培养箱孵育1-2小时（一旦确定孵育时长，后续每天都保持一致）。

6、再用酶标仪测定OD值（检测波长450nm（430-490nm），参比波长600-650nm）

数据分析：

• 实验孔吸光度=含有细胞、培养基、CCK-8和待测化合物的孔的吸光度

• 空白孔吸光度=含有培养基和CCK-8的孔的吸光度

• 对照孔吸光度=含有细胞、培养基、CCK-8的孔的吸光度

1、细胞存活率（%）=（实验孔吸光度-空白孔吸光度）/（对照孔吸光度-空白孔吸光度）*100

2、抑制率（%）=（对照孔吸光度-实验孔吸光度）/（对照孔吸光度-空白孔吸光度）*100

注意事项：

1、由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。

2、当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔加培养基或者PBS，不作为测定孔用。

3、用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定，且要擦拭干净样品板。