CRISPR-KO/CRISPR-a（慢病毒）

By Kaiyi

CRISPR基因编辑基本原理

CRISPR/Cas9是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA指导Cas9蛋白对靶向基因进行修饰的技术，该系统灵活简单、可以对特定基因组位点进行切割置换的，特异性高、细胞毒性低。

CRISPR/Cas9系统是利用Cas9核酸酶在向导RNA的指引下通过识别基因组的任何位点保守的间隔相邻基序（PAM，序列为NGG），在PAM的上游对DNA进行定点切割。使用CRISPR/Cas9系统可以很简便地为内源性基因标记标签。除此之外，CRISPR/Cas9系统也可以用于其他的基因组工程，如基因抑制（突变，缺失，插入），用于启动子研究的荧光素酶报告基因置换或绿色荧光蛋白基因置换，基因敲入以及用于治疗的基因修复等。

CRISPR基因调控（CRISPR-a）原理

催化活性失活的Cas9（dCas9）可以与不同形式的转录复合物结合以实现CRISPR介导的内源性基因转录调控。对于转录激活，通常可使用协同激活介导系统（Synergistic Activation Mediator，SAM）。该系统使用了三种组件：dCas9/VP64融合蛋白（pLV-EF1A>dCas9/VP64/Bsd）、MS2/P65/HSF1辅助蛋白（pLV-EF1A>MS2/P65/HSF1/Hygro）、以及一个修饰的gRNA（pLV[msgRNA]-Puro-U6）。

dCas9蛋白经过改造结合了VP64，一种协同转录激活因子，而经过修饰的gRNA则含有一个MS2适配体，可以招募MS2复合物。MS2复合物包含转录激活结构域NF-kB (p65)和HSF1。VP64包含四个来源于单纯疱疹病毒蛋白16的重复序列，其C端融合至Cas9蛋白使其可以招募转录激活相关的蛋白来激活基因表达。p65和HSF1的转录激活结构域还可以作为潜在的转录激活因子招募与启动子或增强子结合的辅因子。总而言之，dCas9/VP64和MS2/P65/HSF1复合物可以协同工作的方式以激活靶基因表达。

基本步骤：首先向细胞共转导两种分别携带dCas9:VP64和MS2:P65:HSF1的慢病毒，进行抗性筛选。然后使用递送msgRNA的第三种慢病毒转导细胞，并用另一种抗生素进行筛选。

CRISPR-KO实验步骤

一、 sgRNA靶序列的确定

sgRNA的设计原则：
- 选择PAM位点（NGG）的前20个核苷酸序列作为Cas9核酸酶识别靶点
- 如果想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上
- 通常基因会转录成多个isoforms，所以选择尽量靠近5’端的公共部分（consensus CDS），保证每个isoform都会成功移码突变
- 应避免以4个以上的T结尾（poly T是真核生物终止转录的信号）以免提前终止转录；尽量避开GC富集区域，（GC%含量最佳为40%-60%），以防止甲基化对互补配对的干扰
- 如果构建U6启动子或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率
- 全基因的脱靶效应分析，需要考虑脱靶位点的错配碱基数，最多不超过5个
设计网站：
- 从赛默飞网站找：TrueGuide Synthetic gRNA | Thermo Fisher Scientific - CN输入基因ID/Gene Symbol和物种（Human/mouse）搜索以后，点击Details就能看到target序列的信息
- https://www.takarabio.com/learning-centers/gene-function/gene-editing/gene-editing-tools-and-information/sgrna-design-tools
- http://www.crisprscan.org/
- https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool
- http://crispor.gi.ucsc.edu/
脱靶分析网站：
- https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/（输入sgRNA序列时需带NGG）
Non-targeting 20 nt scramble guide RNA (Control sgRNA)：
- GTATTACTGATATTGGTGGG

二、质粒酶切位点+靶序列引物的设计

载体采用LentiCRISPRv2（https://www.addgene.org/52961/），BsmBI酶可以切下来一个2Kbp左右的片段，U6可以用来测序。

BsmBI的酶切位点：识别非回文序列，在识别序列外进行切割，酶切后是粘性末端；在酶切V2质粒后产生两个不一样的粘性末端，所以不会自连。
值得注意的是，BsmBI只在CRISPR V2空载质粒上有两个酶切位点，在已经构建好的sg质粒中无酶切位点（CRISP2 V2经酶切后，由于一部分酶切位点在1850左右bp的片段里，已经丢失），因此构建sgRNA只能用CRISPR V2空载质粒构建，而不能用已经构建好的sg质粒再来构建别的sg质粒。
酶切连接后sgRNA target序列正好在U6启动子下游，sgRNA target序列下游就是gRNA scaffold序列，与sgRNA一起转录出来发挥gRNA的引导功能。

正向引物：在20个碱基（不包含NGG）前加CACCG序列（形成粘性末端），最后是25碱基
反向引物：在20个碱基前加AAAC，最后面加C（使互补配对更稳定），最后是25碱基
注意序列正反顺序（订引物时从5‘-3’）！
如果载体不脱磷，oligo不需要磷酸化

三、载体酶切

【在LentiCRISPRv2载体中有两个BsmBI酶切位点，两个位点之间的片段为1885bp，酶切连接后sgRNA正好在U6启动子下游，连接后的sgRNA下游就是gRNA scaffold序列；BsmBI酶切之后不需要CIP脱磷也不会自连】

在冰上配置以下酶切体系（酶最后加）

LentiCRISPRv2 plasmid

2μg （80ng/μL，即25μL）

BsmBI-v2（BioLabs, R0739S）

1μL

10X NEB buffer r3.1

3μL

H2O

up to 30μL (1μL)

total

30 uL

加入以上成分，于55摄氏度酶切4小时（说明书是15分钟，但是容易切不完全）；
热灭活 80℃ 20分钟；

四、琼脂糖电泳+胶回收纯化

【配置电泳液与1%琼脂糖凝胶】

配置1X TAE：量筒量取980mL去离子水，20mL50x TAE，混匀溶解（TAE主要成分包含Tris/冰醋酸/EDTA）。重复配置一次，得到2L的1X TAE溶液（下一步电泳时也要用）。
配置琼脂糖溶液：天平称量0.5g琼脂糖，倒入锥形瓶，加入50mL 1X TAE溶液【小块胶】，锥形瓶盖上盖子，微波炉高火加热1.5-2min；
趁热加入10000× GelRed核酸染料【也可以在DNA体系中添加sybr green作为替代】，摇晃均匀。

【琼脂糖电泳】

提前清洗胶板、齿梳；组装胶板与齿梳；
在确认胶板水平的情况下倒入琼脂糖溶液，按压，排出气泡；
静候冷却15min以上，凝胶成形。拔出齿梳；
打开电泳槽盖子，在电泳槽中加入足量1X TAE（液面可没过凝胶），放入凝胶【注意摆放的方向，有孔的一端朝左侧黑色负极，电泳槽上也有箭头】。
先在凝胶孔洞每排首尾各加2.5微升DNA Ladder（DL10000+的Ladder）;
酶切的CRISPR质粒体系加入Gel Loading Dye, Purple (6X)，混匀，加到胶的孔里；
加样时需要添加没有酶切的环状质粒+Gel Loading Dye作为对照；
每个样本孔之间空一格，方便切胶回收。

补充：正常超螺旋结构最紧凑，跑最快；直链线性质粒由于双链都断开变成松弛的线性DNA，不如超螺旋紧密，跑得相对慢；开环质粒，DNA双链的其中一条链断开，导致超螺旋能量被释放而使质粒变成松弛的环状结构，结构臃肿，跑得最慢。

盖上盖子，接通电源（红对红，黑对黑），120V电压电泳20分钟；
显影观察（注意排气泡）。

【胶回收】

（采用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)试剂盒或其他品牌试剂盒，具体详见说明书）

注意：当天现配琼脂糖凝胶和TAE电泳液（不能用重复回收的）；提前准备1.5mL 离心管，写完标签，放一个黄色枪头；

配置1.5%琼脂糖凝胶，趁热加入10000X的GelRed，倒入凝胶槽室温冷却 15 min。
将PCR或酶切产物与10x Loading Buffer混合（50μL每孔，45：5混合），首尾加DL10000/DL2000的DNA Marker 5μL，上样到琼脂糖凝胶上进行电泳（可以适量延长电泳时间，如30min，使条带尽可能分离）。
金属浴提前加热至50℃；
从琼脂糖凝胶上切下单一的目的DNA条带，放入干净的1.5 mL离心管中，进行称重。
加入3倍体积的Buffer QG到1体积的凝胶中。(100 mg大约等于100uL)
将离心管放入 50℃金属浴中，直到凝胶完全解。(此时溶液的颜色应变为黄色)
向离心管加入一个凝胶体积的异丙醇，上下翻转离心管，使液体混匀。
为了结合DNA，将上述样品加到柱子中，12000 rpm 离心1min。【如果离心管内液体体积较多，可以在同一个柱子中多次重复加样，离心回收DNA，以提高单管的DNA浓度】
弃废液，向柱子中加入 500 μL Buffer QG，12000rpm 离心1min。
为了洗柱子，弃废液，再向柱子加入 750 L Buffer PE，12000 pm 离心 1 min。
弃废液，12000rpm 空离 1min。
将收集管换成1.5 mL离心管（用剪刀减去耳朵），加入30-50 uL Buffer EB 或水洗脱DNA(注意EB 加到滤膜上)，室温静置 1min 后，12000rpm 离心1min。
使用Nano Drop 系统测量回收产物浓度，注意使用相应的溶液做 Blank。
如10ug的 CRISPR V2质粒酶切完回收可以得到60ng/ul浓度的30ul左右产物。

五、Oligo退火形成duplex

退火方法一：用烧杯量取100-150mL自来水，微波炉高热煮沸后倒入烧杯/塑料盒，将配置好的引物对置入水浴，待其自然降温（约30-40分钟）；
退火方法二：PCR仪反应条件：37℃ 30min → 95℃ 5min，然后按照5℃/min降温到25℃；
Duplex配置体系：

oligo1

1uL（100uM，用干粉直接配）

oligo2

1uL（100uM，用干粉直接配）

ddH2O

8uL

total

10uL

~~退火产物验证：琼脂糖凝胶电泳检测退火是否成功，完成退火的条带会特别亮~~
用ddH2O，1：200稀释退火后的产物

六、T4酶连接

在冰上按以下比例配置载体连接体系（酶最后加），混匀，室温连接4-6h（通常PCR仪设置25℃，连接1-2h），或16℃过夜；

T4 DNA ligase (BioLabs, M0202L)

0.25 μL

1 μL

T4 DNA ligase reaction buffer (10X)

0.5 μL

2 μL

digested LentiCRISPRv2 plasmid

4 μL（32ng）

50ng（0.02pmol）

稀释后的Duplex

1 μL (0.015pmol)

37.5ng (0.06pmol)

Nuclease-free water

to 5 μL

to 20 μL

total

5 μL

20 μL

65℃热灭活10min，开始转化。

七、转化

将金属浴预热至42℃，用烘箱37℃预热LB固体平板（加抗生素）和LB液体培养基（不加抗生素）
从-80冰箱取一管DH5α感受态细胞（100μL），在冰上解冻
向上述步骤得到的5 μL重组质粒内加入5倍体积以上的感受态细胞（30-50μL）冰上放置30min（不要吹打）
感受态细胞42℃热激1min
冰上孵育2min
向管内加入600μL预热的LB液体培养基（不含抗生素），吹打混匀
将管子置于孔板上，37℃，225rpm摇菌1h
5000rpm离心1min，弃去上清，用100μL-200μL培养基重悬
在LB固体平板内加入重悬的菌液，用涂布棒涂布，室温放置2min，使其充分吸收
待菌液吸收，倒置平板，37℃培养16h

八、挑单克隆、测序

生物安全柜内、酒精灯旁，准备若干离心管，每管加一定量培养基配制所需要的选择性培养基（如5mL培养基加5μL的1000X氨苄青霉素）；
酒精灯旁，用加样枪挑菌落，则选择100μL黄枪头，挑完直接把抢头打进管子里。
37℃温箱内固定在摇床上，盖子不能盖紧，220rpm振摇过夜【16个小时】，菌液送测序。平板和多余的菌液可放置于4℃保存。

九、质粒扩增

如质粒序列无误，则可进一步扩增、提质粒。
生物安全柜内、酒精灯旁提前配制LB液体培养基，准备若干15mL的离心管，添加5mL（小提）或15mL（中提）的LB液体培养基，以及1000X的氨苄青霉素；
酒精灯旁，向选择性LB培养基内添加4℃冰箱保存的测序后的菌液或者-80℃保存的甘油菌，加完直接把抢头打进管子里。
37℃温箱内固定在摇床上，盖子不能盖紧，220rpm振摇过夜【16个小时】。
第二天培养基变得混浊，说明细菌生长良好。

十、质粒中提

挑取单菌落/吸取甘油菌接种于具有相应抗性的LB培养基（如1000X的Amp）的250mL锥形瓶中，37℃、180rpm过夜培养；
第二天取出锥形瓶，50mL离心管分装，4℃ 2000g（rcf）离心10min，沉淀即为细菌；
离心等待时，将Buffer P3提前置于4℃冰箱预冷；
用6mL Buffer P1依次重悬5管细菌沉淀（Buffer P1提前添加RNase A和LyseBlue，于4℃存放）；
再加入6 mL Buffer P2，上下翻转4-6次混匀（此时混合液变为蓝色），室温静置5min；
加入6mL 预冷的Buffer P3，上下翻转4-6次混匀（此时混合液变为无色，会有乳白色絮状沉淀）；
将裂解液倒入滤筒（QIAfilter Cartridge）中，不插入活塞，室温孵育10min；
等待静置期间，在架子上放置过滤柱（HiSpeed Tip），在架子下放置接液容器，向柱子中加入4mL Buffer QBT，等待液体从下端流净；
QBT流净后，向滤筒内插入活塞，将裂解液打入过滤柱；
使用20mL的Buffer QC清洗柱子，等待期间可以先量取异丙醇与70%乙醇；
柱子下放置15mL收集管，使用5mL Buffer QF洗脱DNA；
向收集管中加入3.5mL异丙醇（927门后柜子）沉淀DNA，混匀孵育5min；
把20mL注射器与收集膜（QIAprecipitator）相连，将上述液体倒入注射器中，插入活塞，使用恒力推动活塞挤出液体，尽量挤净；
加入2mL 70%乙醇清洗收集膜一次，并空吹几次，尽量排尽乙醇（注意不要用力过度！收集膜可能会裂！）；
将收集膜与5mL 注射器相连，使用500 μL Buffer TE清洗收集膜2次，用1.5mL离心管收集DNA。（TE可能会影响下一步的酶促反应，可换成ddH2O来收集）；
使用Nano Drop系统测量回收产物浓度，注意使用相应的溶液做Blank；

十一、病毒包装浓缩

1）293T细胞铺板

消化贴壁293T细胞，离心，细胞计数；
取3-5×10^6细胞铺于10cm皿或T25瓶（可直接用无抗培养基铺板），过夜培养至密度达到70-90%

2）使用PEI进行病毒包装

A液配置：取 1.5 ml 灭菌旋盖 EP 管，根据质粒的浓度（前期测定得到），将包装质粒pCMV-dR8.9 (psPAX2)、包膜质粒pCMV-VSV-G (pMD2.G)、转移质粒（目的基因）配比为7.5μg：5μg：10μg（3：2：4），添加至500μL opti-MEM（无血清无双抗）中，移液枪轻柔混匀20次后室温静置5min；【此处为T25的细胞培养瓶，T75则用量翻倍，T150用量翻3倍】
B液配置：取 1.5 ml 灭菌旋盖EP 管，取PEI（一般配成1μg/mL）50μg（50μL）添加到500μL opti-MEM（无血清无双抗）中，移液枪轻柔混匀20次后室温静置5min；
将B液逐滴滴加至A液中，每加一次移液枪轻柔混匀一遍，室温静置20min（这个时间处理细胞：对于T25瓶，取10mL DMEM培养基（最好无血清）37℃预热，在加转染试剂前吸掉原有培养基，用PBS洗一遍）；
细胞加样：将静置好的转染试剂（A+B）缓缓滴加到293T细胞中（10cm皿或T25），在滴加过程中轻柔晃动培养板，使转染试剂均匀扩散；
在培养6-7h时，将培养基预热至 37 ℃；
培养6-8h后将培养基更换为新鲜的含2-5%FBS的培养基，换液时动作轻柔以防细胞漂起。

溶液B

溶液A

Opti-MEM：500 μL

LentiCRISPR v2-gRNA plasmid （10 μg = x μL）

PEI：50 μL

CMV-dR8.9 (psPAX2) packaging plasmid （7.5 μg = y μL）

pCMV-VSV-G (pMD2.G) envelope plasmid （5μg = z μL）

Opti-MEM：500 μL

如果使用Lipo3000进行病毒包装，则包装质粒：包膜质粒：目的基因=3：2：5，Lipo3000（μL）和DNA（μg）推荐比例为2.5：1。

溶液1

溶液2

Opti-MEM：121.15 μL

包装质粒pCMV-dR8.9（1.5μg = x μL）

Lipo3000：3.75μL（或7.5，第一次需要摸索条件）

包膜质粒pCMV-VSV-G （1μg = y μL）

目的质粒（2.5μg = z μL）

Opti-MEM（125-x-y-z-10）μL

Lipo3000TM试剂 10μL （最后加！！！）

3）收毒及浓缩、目的细胞铺板

转染48/72h后收取病毒上清于15mL离心管中，离心机提前预冷，于4℃，3000rpm离心10min，去除细胞碎片；
用注射器吸取上清（吸不到的话可以抽出活塞直接往注射器针筒里倒），并经0.45μm滤膜（黄色）过滤至50mL离心管；
加入病毒液1/3体积的PEG8000（929冰箱侧壁），过夜4℃浓缩。
当晚铺板需要感染的细胞（如肿瘤细胞）：24孔板上，每孔接种5*10^5个细胞，每孔培养基体积500ul。或12孔板接种1*10^6个细胞，每孔培养基体积1000ul。

4）收毒分装

将病毒液1600G 4℃离心 60min；
弃上清，如原有30mL上清，则加入500ul-1mL opti-mem无血清培养基重悬（原上清液体积与重悬液体积约为30-50：1），重悬时避免产生气泡；
将重悬液吸取至一离心管，12000rpm离心2-3分钟；
取上清液，按照每份100ul分装于冻存管（橙色帽，926第二个抽屉），-80度冰箱保存

十二、病毒感染

-80℃拿出来的病毒在37℃迅速解冻，跟解冻细胞一样；
如带有荧光，可进行感染预实验（详见慢病毒使用手册）
病毒感染：
- 悬浮细胞：需要加Ploybrene再Spinfection：细胞浓度在1-4*10^6，向病毒液中加入1000X的Ploybrene（10mg/mL，每1mL体系加1μL），整个孔板室温1000g离心90min，使病毒和细胞充分接触；
- 贴壁细胞：直接向病毒液中加1000X的Polybrene，使最终每1mL培养基体系对应1μLPolybrene，再向目的细胞加入病毒上清；
病毒感染16-24h后换液，48h胰酶消化传代；

十三、嘌呤霉素筛选

1、确定最佳嘌呤霉素浓度：

每个细胞系对嘌呤霉素的敏感性不同，在开始实验之前要确定细胞系的最佳嘌呤霉素浓度
Day1: 准备六孔板或者24孔板，铺板目的细胞，第二天的细胞汇合度应在80%-90%
Day2: 加入嘌呤霉素，使每个孔的嘌呤霉素终浓度在1µg/ml到10µg/ml，具体梯度的设置数量可以去查查目的细胞相关的文献，也可以直接设置10个梯度，增量为1μg/mL
Day3：每天检查细胞，每隔一天更换为新鲜的含嘌呤霉素的培养基，选择在三到五天后导致细胞完全死亡的嘌呤霉素的最低浓度。

2、添加最佳浓度的嘌呤霉素

转染48h后，铺板感染后的细胞和未感染的对照细胞，至第二天汇合度在70%-80%。
按之前得到的最佳浓度加入puromycin来筛选细胞，如1mL的培养基，加5μL的嘌呤酶素（1mg/mL），也就是说嘌呤霉素的终浓度是5μg/mL。
空细胞加puro组应当在三到四天内全部死亡，感染病毒组剩下的基本可以认为都是阳性细胞。
加了嘌呤霉素的培养基要每天更换，逐渐降低抗生素维持浓度（相较之前的药筛浓度，浓度减至之前浓度的 1/2~1/4 或更低）继续对感染后的细胞进行筛选和扩增。

十四、挑取单克隆

详见CRISPR-KI相关部分。

十五、单克隆鉴定

Sanger测序
PCR鉴定：在敲除片段的上中下处设计三对引物，提取WT细胞以及KO细胞的total DNA，进行PCR。
因为gRNA设计的优劣差异，细胞转染感染程度高低，gRNA效价的高低都不同，所以在单克隆验证时可能存在敲除效果有些差异，尽量选取测序结果里缺失或者突变程度比较深的克隆，这样可以提高敲除效果；另外就是质粒筛选时，可以选用几条gRNA质粒或者慢病毒同时共转细胞，这样增加对同一条DNA编辑的概率，从而提高最终的敲除效果。

十六、细胞保种

在扩增的过程中持续冻存保种，保证每株细胞至少冻存 6 支。
冻存2-3后，取出一支复苏，判断细胞生长状态。

PreviousshRNA/RNP脂质体转染 NextCRISPR-KI（脂质体转染）

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CRISPR基因编辑基本原理

CRISPR基因调控（CRISPR-a）原理

CRISPR-KO实验步骤

一、 sgRNA靶序列的确定

sgRNA的设计原则：
- 选择PAM位点（NGG）的前20个核苷酸序列作为Cas9核酸酶识别靶点
- 如果想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上
- 通常基因会转录成多个isoforms，所以选择尽量靠近5’端的公共部分（consensus CDS），保证每个isoform都会成功移码突变
- 应避免以4个以上的T结尾（poly T是真核生物终止转录的信号）以免提前终止转录；尽量避开GC富集区域，（GC%含量最佳为40%-60%），以防止甲基化对互补配对的干扰
- 如果构建U6启动子或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率
- 全基因的脱靶效应分析，需要考虑脱靶位点的错配碱基数，最多不超过5个
设计网站：
- 从赛默飞网站找：TrueGuide Synthetic gRNA | Thermo Fisher Scientific - CN输入基因ID/Gene Symbol和物种（Human/mouse）搜索以后，点击Details就能看到target序列的信息
- https://www.takarabio.com/learning-centers/gene-function/gene-editing/gene-editing-tools-and-information/sgrna-design-tools
- http://www.crisprscan.org/
- https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool
- http://crispor.gi.ucsc.edu/
脱靶分析网站：
- https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/（输入sgRNA序列时需带NGG）
Non-targeting 20 nt scramble guide RNA (Control sgRNA)：
- GTATTACTGATATTGGTGGG

二、质粒酶切位点+靶序列引物的设计

载体采用LentiCRISPRv2（https://www.addgene.org/52961/），BsmBI酶可以切下来一个2Kbp左右的片段，U6可以用来测序。

BsmBI的酶切位点：识别非回文序列，在识别序列外进行切割，酶切后是粘性末端；在酶切V2质粒后产生两个不一样的粘性末端，所以不会自连。
值得注意的是，BsmBI只在CRISPR V2空载质粒上有两个酶切位点，在已经构建好的sg质粒中无酶切位点（CRISP2 V2经酶切后，由于一部分酶切位点在1850左右bp的片段里，已经丢失），因此构建sgRNA只能用CRISPR V2空载质粒构建，而不能用已经构建好的sg质粒再来构建别的sg质粒。
酶切连接后sgRNA target序列正好在U6启动子下游，sgRNA target序列下游就是gRNA scaffold序列，与sgRNA一起转录出来发挥gRNA的引导功能。

正向引物：在20个碱基（不包含NGG）前加CACCG序列（形成粘性末端），最后是25碱基
反向引物：在20个碱基前加AAAC，最后面加C（使互补配对更稳定），最后是25碱基
注意序列正反顺序（订引物时从5‘-3’）！
如果载体不脱磷，oligo不需要磷酸化

三、载体酶切

在冰上配置以下酶切体系（酶最后加）

LentiCRISPRv2 plasmid

2μg （80ng/μL，即25μL）

BsmBI-v2（BioLabs, R0739S）

1μL

10X NEB buffer r3.1

3μL

H2O

up to 30μL (1μL)

total

30 uL

加入以上成分，于55摄氏度酶切4小时（说明书是15分钟，但是容易切不完全）；
热灭活 80℃ 20分钟；

四、琼脂糖电泳+胶回收纯化

【配置电泳液与1%琼脂糖凝胶】

配置1X TAE：量筒量取980mL去离子水，20mL50x TAE，混匀溶解（TAE主要成分包含Tris/冰醋酸/EDTA）。重复配置一次，得到2L的1X TAE溶液（下一步电泳时也要用）。
配置琼脂糖溶液：天平称量0.5g琼脂糖，倒入锥形瓶，加入50mL 1X TAE溶液【小块胶】，锥形瓶盖上盖子，微波炉高火加热1.5-2min；
趁热加入10000× GelRed核酸染料【也可以在DNA体系中添加sybr green作为替代】，摇晃均匀。

【琼脂糖电泳】

提前清洗胶板、齿梳；组装胶板与齿梳；
在确认胶板水平的情况下倒入琼脂糖溶液，按压，排出气泡；
静候冷却15min以上，凝胶成形。拔出齿梳；
打开电泳槽盖子，在电泳槽中加入足量1X TAE（液面可没过凝胶），放入凝胶【注意摆放的方向，有孔的一端朝左侧黑色负极，电泳槽上也有箭头】。
先在凝胶孔洞每排首尾各加2.5微升DNA Ladder（DL10000+的Ladder）;
酶切的CRISPR质粒体系加入Gel Loading Dye, Purple (6X)，混匀，加到胶的孔里；
加样时需要添加没有酶切的环状质粒+Gel Loading Dye作为对照；
每个样本孔之间空一格，方便切胶回收。

盖上盖子，接通电源（红对红，黑对黑），120V电压电泳20分钟；
显影观察（注意排气泡）。

【胶回收】

（采用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)试剂盒或其他品牌试剂盒，具体详见说明书）

注意：当天现配琼脂糖凝胶和TAE电泳液（不能用重复回收的）；提前准备1.5mL 离心管，写完标签，放一个黄色枪头；

配置1.5%琼脂糖凝胶，趁热加入10000X的GelRed，倒入凝胶槽室温冷却 15 min。
将PCR或酶切产物与10x Loading Buffer混合（50μL每孔，45：5混合），首尾加DL10000/DL2000的DNA Marker 5μL，上样到琼脂糖凝胶上进行电泳（可以适量延长电泳时间，如30min，使条带尽可能分离）。
金属浴提前加热至50℃；
从琼脂糖凝胶上切下单一的目的DNA条带，放入干净的1.5 mL离心管中，进行称重。
加入3倍体积的Buffer QG到1体积的凝胶中。(100 mg大约等于100uL)
将离心管放入 50℃金属浴中，直到凝胶完全解。(此时溶液的颜色应变为黄色)
向离心管加入一个凝胶体积的异丙醇，上下翻转离心管，使液体混匀。
为了结合DNA，将上述样品加到柱子中，12000 rpm 离心1min。【如果离心管内液体体积较多，可以在同一个柱子中多次重复加样，离心回收DNA，以提高单管的DNA浓度】
弃废液，向柱子中加入 500 μL Buffer QG，12000rpm 离心1min。
为了洗柱子，弃废液，再向柱子加入 750 L Buffer PE，12000 pm 离心 1 min。
弃废液，12000rpm 空离 1min。
将收集管换成1.5 mL离心管（用剪刀减去耳朵），加入30-50 uL Buffer EB 或水洗脱DNA(注意EB 加到滤膜上)，室温静置 1min 后，12000rpm 离心1min。
使用Nano Drop 系统测量回收产物浓度，注意使用相应的溶液做 Blank。
如10ug的 CRISPR V2质粒酶切完回收可以得到60ng/ul浓度的30ul左右产物。

五、Oligo退火形成duplex

退火方法一：用烧杯量取100-150mL自来水，微波炉高热煮沸后倒入烧杯/塑料盒，将配置好的引物对置入水浴，待其自然降温（约30-40分钟）；
退火方法二：PCR仪反应条件：37℃ 30min → 95℃ 5min，然后按照5℃/min降温到25℃；
Duplex配置体系：

oligo1

1uL（100uM，用干粉直接配）

oligo2

1uL（100uM，用干粉直接配）

ddH2O

8uL

total

10uL

~~退火产物验证：琼脂糖凝胶电泳检测退火是否成功，完成退火的条带会特别亮~~
用ddH2O，1：200稀释退火后的产物

六、T4酶连接

在冰上按以下比例配置载体连接体系（酶最后加），混匀，室温连接4-6h（通常PCR仪设置25℃，连接1-2h），或16℃过夜；

T4 DNA ligase (BioLabs, M0202L)

0.25 μL

1 μL

T4 DNA ligase reaction buffer (10X)

0.5 μL

2 μL

digested LentiCRISPRv2 plasmid

4 μL（32ng）

50ng（0.02pmol）

稀释后的Duplex

1 μL (0.015pmol)

37.5ng (0.06pmol)

Nuclease-free water

to 5 μL

to 20 μL

total

5 μL

20 μL

65℃热灭活10min，开始转化。

七、转化

将金属浴预热至42℃，用烘箱37℃预热LB固体平板（加抗生素）和LB液体培养基（不加抗生素）
从-80冰箱取一管DH5α感受态细胞（100μL），在冰上解冻
向上述步骤得到的5 μL重组质粒内加入5倍体积以上的感受态细胞（30-50μL）冰上放置30min（不要吹打）
感受态细胞42℃热激1min
冰上孵育2min
向管内加入600μL预热的LB液体培养基（不含抗生素），吹打混匀
将管子置于孔板上，37℃，225rpm摇菌1h
5000rpm离心1min，弃去上清，用100μL-200μL培养基重悬
在LB固体平板内加入重悬的菌液，用涂布棒涂布，室温放置2min，使其充分吸收
待菌液吸收，倒置平板，37℃培养16h

八、挑单克隆、测序

生物安全柜内、酒精灯旁，准备若干离心管，每管加一定量培养基配制所需要的选择性培养基（如5mL培养基加5μL的1000X氨苄青霉素）；
酒精灯旁，用加样枪挑菌落，则选择100μL黄枪头，挑完直接把抢头打进管子里。
37℃温箱内固定在摇床上，盖子不能盖紧，220rpm振摇过夜【16个小时】，菌液送测序。平板和多余的菌液可放置于4℃保存。

九、质粒扩增

如质粒序列无误，则可进一步扩增、提质粒。
生物安全柜内、酒精灯旁提前配制LB液体培养基，准备若干15mL的离心管，添加5mL（小提）或15mL（中提）的LB液体培养基，以及1000X的氨苄青霉素；
酒精灯旁，向选择性LB培养基内添加4℃冰箱保存的测序后的菌液或者-80℃保存的甘油菌，加完直接把抢头打进管子里。
37℃温箱内固定在摇床上，盖子不能盖紧，220rpm振摇过夜【16个小时】。
第二天培养基变得混浊，说明细菌生长良好。

十、质粒中提

挑取单菌落/吸取甘油菌接种于具有相应抗性的LB培养基（如1000X的Amp）的250mL锥形瓶中，37℃、180rpm过夜培养；
第二天取出锥形瓶，50mL离心管分装，4℃ 2000g（rcf）离心10min，沉淀即为细菌；
离心等待时，将Buffer P3提前置于4℃冰箱预冷；
用6mL Buffer P1依次重悬5管细菌沉淀（Buffer P1提前添加RNase A和LyseBlue，于4℃存放）；
再加入6 mL Buffer P2，上下翻转4-6次混匀（此时混合液变为蓝色），室温静置5min；
加入6mL 预冷的Buffer P3，上下翻转4-6次混匀（此时混合液变为无色，会有乳白色絮状沉淀）；
将裂解液倒入滤筒（QIAfilter Cartridge）中，不插入活塞，室温孵育10min；
等待静置期间，在架子上放置过滤柱（HiSpeed Tip），在架子下放置接液容器，向柱子中加入4mL Buffer QBT，等待液体从下端流净；
QBT流净后，向滤筒内插入活塞，将裂解液打入过滤柱；
使用20mL的Buffer QC清洗柱子，等待期间可以先量取异丙醇与70%乙醇；
柱子下放置15mL收集管，使用5mL Buffer QF洗脱DNA；
向收集管中加入3.5mL异丙醇（927门后柜子）沉淀DNA，混匀孵育5min；
把20mL注射器与收集膜（QIAprecipitator）相连，将上述液体倒入注射器中，插入活塞，使用恒力推动活塞挤出液体，尽量挤净；
加入2mL 70%乙醇清洗收集膜一次，并空吹几次，尽量排尽乙醇（注意不要用力过度！收集膜可能会裂！）；
将收集膜与5mL 注射器相连，使用500 μL Buffer TE清洗收集膜2次，用1.5mL离心管收集DNA。（TE可能会影响下一步的酶促反应，可换成ddH2O来收集）；
使用Nano Drop系统测量回收产物浓度，注意使用相应的溶液做Blank；

十一、病毒包装浓缩

1）293T细胞铺板

消化贴壁293T细胞，离心，细胞计数；
取3-5×10^6细胞铺于10cm皿或T25瓶（可直接用无抗培养基铺板），过夜培养至密度达到70-90%

2）使用PEI进行病毒包装

A液配置：取 1.5 ml 灭菌旋盖 EP 管，根据质粒的浓度（前期测定得到），将包装质粒pCMV-dR8.9 (psPAX2)、包膜质粒pCMV-VSV-G (pMD2.G)、转移质粒（目的基因）配比为7.5μg：5μg：10μg（3：2：4），添加至500μL opti-MEM（无血清无双抗）中，移液枪轻柔混匀20次后室温静置5min；【此处为T25的细胞培养瓶，T75则用量翻倍，T150用量翻3倍】
B液配置：取 1.5 ml 灭菌旋盖EP 管，取PEI（一般配成1μg/mL）50μg（50μL）添加到500μL opti-MEM（无血清无双抗）中，移液枪轻柔混匀20次后室温静置5min；
将B液逐滴滴加至A液中，每加一次移液枪轻柔混匀一遍，室温静置20min（这个时间处理细胞：对于T25瓶，取10mL DMEM培养基（最好无血清）37℃预热，在加转染试剂前吸掉原有培养基，用PBS洗一遍）；
细胞加样：将静置好的转染试剂（A+B）缓缓滴加到293T细胞中（10cm皿或T25），在滴加过程中轻柔晃动培养板，使转染试剂均匀扩散；
在培养6-7h时，将培养基预热至 37 ℃；
培养6-8h后将培养基更换为新鲜的含2-5%FBS的培养基，换液时动作轻柔以防细胞漂起。

溶液B

溶液A

Opti-MEM：500 μL

LentiCRISPR v2-gRNA plasmid （10 μg = x μL）

PEI：50 μL

CMV-dR8.9 (psPAX2) packaging plasmid （7.5 μg = y μL）

pCMV-VSV-G (pMD2.G) envelope plasmid （5μg = z μL）

Opti-MEM：500 μL

如果使用Lipo3000进行病毒包装，则包装质粒：包膜质粒：目的基因=3：2：5，Lipo3000（μL）和DNA（μg）推荐比例为2.5：1。

溶液1

溶液2

Opti-MEM：121.15 μL

包装质粒pCMV-dR8.9（1.5μg = x μL）

Lipo3000：3.75μL（或7.5，第一次需要摸索条件）

包膜质粒pCMV-VSV-G （1μg = y μL）

目的质粒（2.5μg = z μL）

Opti-MEM（125-x-y-z-10）μL

Lipo3000TM试剂 10μL （最后加！！！）

3）收毒及浓缩、目的细胞铺板

转染48/72h后收取病毒上清于15mL离心管中，离心机提前预冷，于4℃，3000rpm离心10min，去除细胞碎片；
用注射器吸取上清（吸不到的话可以抽出活塞直接往注射器针筒里倒），并经0.45μm滤膜（黄色）过滤至50mL离心管；
加入病毒液1/3体积的PEG8000（929冰箱侧壁），过夜4℃浓缩。
当晚铺板需要感染的细胞（如肿瘤细胞）：24孔板上，每孔接种5*10^5个细胞，每孔培养基体积500ul。或12孔板接种1*10^6个细胞，每孔培养基体积1000ul。

4）收毒分装

将病毒液1600G 4℃离心 60min；
弃上清，如原有30mL上清，则加入500ul-1mL opti-mem无血清培养基重悬（原上清液体积与重悬液体积约为30-50：1），重悬时避免产生气泡；
将重悬液吸取至一离心管，12000rpm离心2-3分钟；
取上清液，按照每份100ul分装于冻存管（橙色帽，926第二个抽屉），-80度冰箱保存

十二、病毒感染

-80℃拿出来的病毒在37℃迅速解冻，跟解冻细胞一样；
如带有荧光，可进行感染预实验（详见慢病毒使用手册）
病毒感染：
- 悬浮细胞：需要加Ploybrene再Spinfection：细胞浓度在1-4*10^6，向病毒液中加入1000X的Ploybrene（10mg/mL，每1mL体系加1μL），整个孔板室温1000g离心90min，使病毒和细胞充分接触；
- 贴壁细胞：直接向病毒液中加1000X的Polybrene，使最终每1mL培养基体系对应1μLPolybrene，再向目的细胞加入病毒上清；
病毒感染16-24h后换液，48h胰酶消化传代；

十三、嘌呤霉素筛选

1、确定最佳嘌呤霉素浓度：

每个细胞系对嘌呤霉素的敏感性不同，在开始实验之前要确定细胞系的最佳嘌呤霉素浓度
Day1: 准备六孔板或者24孔板，铺板目的细胞，第二天的细胞汇合度应在80%-90%
Day2: 加入嘌呤霉素，使每个孔的嘌呤霉素终浓度在1µg/ml到10µg/ml，具体梯度的设置数量可以去查查目的细胞相关的文献，也可以直接设置10个梯度，增量为1μg/mL
Day3：每天检查细胞，每隔一天更换为新鲜的含嘌呤霉素的培养基，选择在三到五天后导致细胞完全死亡的嘌呤霉素的最低浓度。

2、添加最佳浓度的嘌呤霉素

转染48h后，铺板感染后的细胞和未感染的对照细胞，至第二天汇合度在70%-80%。
按之前得到的最佳浓度加入puromycin来筛选细胞，如1mL的培养基，加5μL的嘌呤酶素（1mg/mL），也就是说嘌呤霉素的终浓度是5μg/mL。
空细胞加puro组应当在三到四天内全部死亡，感染病毒组剩下的基本可以认为都是阳性细胞。
加了嘌呤霉素的培养基要每天更换，逐渐降低抗生素维持浓度（相较之前的药筛浓度，浓度减至之前浓度的 1/2~1/4 或更低）继续对感染后的细胞进行筛选和扩增。

十四、挑取单克隆

详见CRISPR-KI相关部分。

十五、单克隆鉴定

Sanger测序
PCR鉴定：在敲除片段的上中下处设计三对引物，提取WT细胞以及KO细胞的total DNA，进行PCR。
因为gRNA设计的优劣差异，细胞转染感染程度高低，gRNA效价的高低都不同，所以在单克隆验证时可能存在敲除效果有些差异，尽量选取测序结果里缺失或者突变程度比较深的克隆，这样可以提高敲除效果；另外就是质粒筛选时，可以选用几条gRNA质粒或者慢病毒同时共转细胞，这样增加对同一条DNA编辑的概率，从而提高最终的敲除效果。

十六、细胞保种

在扩增的过程中持续冻存保种，保证每株细胞至少冻存 6 支。
冻存2-3后，取出一支复苏，判断细胞生长状态。