CRISPR-KI
By Kaiyi Fu
实验原理
CRISPR-Cas9基因敲入（KI, Knock in）是指Cas9内切酶切割双链DNA时，同时提供一段与靶基因高度同源的DNA修复模板，生物体即可启动HDR修复路径，将一段外源DNA定点插入基因内部。KI的外源基因可以是具有蛋白表达功能的编码基因，可以是参与基因调控的DNA元件，也可以是一段没有功能的DNA序列等。在该修复路径中，需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异的gRNA和Cas9核酸酶一起引入细胞中。在高度同源性DNA模板存在的情况下， HDR机制可以通过同源重组将一段DNA精准地插入特定的基因组位点。
目前CRISPR/Cas9 Gene Knock in系统可用于目的基因引入点突变，从而模拟人类遗传疾病模型；或者将报告基因(如EGFP，mCherry，BFP等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因的表达跟踪目标基因的表达；亦或将功能缺失的DNA片段修复为有功能的DNA片段，即可实现基因治疗的目的。
参考：https://mp.weixin.qq.com/s/tWBEdDL4OyAgZrUgynTIXg
实验流程步骤
有多种方法，包括直接转染Cas、sgRNA、donor质粒（PPP）、质粒+RNP（PRNP）电转、以及PCR产物+RNP（PCRNP）电转等。总体而言更推荐PCRNP法，阴性对照产生荧光的概率更低，具体步骤可以参见下一章节（Cas9-RNP电转染）。
更详细的protocol可参考文献：Rapid generation of homozygous fluorescent knock-in human cells using CRISPR–Cas9 genome editing and validation by automated imaging and digital PCR screening
(Nature protocol，2025）
1、sgRNA的设计
https://apps.thermofisher.com/apps/genome-editing-portal/#/select/experiment（可以同时设计sgRNA与donor）
设计原则：gRNA位置应尽可能靠近插入位点的位置（理想情况下，距离小于10 bp），或直接在起始或终止密码子内选择一个NGG片段。
针对目的基因的CDS的最后一部分，通过网站评分综合选择，选择效率高的sgRNA。
随后将设计好的sgRNA构建到载体（例如PHB-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)）上，或直接用化学合成的sgRNA。
2、设计donor质粒
设计并制作两端同源臂（homologous arm）：截取sgRNA靶点上游500-1000bp左右的序列，制作左同源臂（HA-L）；截取sgRNA靶点下游500-1000bp左右的序列，制作右同源臂（HA-R）。
需要注意的是根据敲入位点，donor需要补齐一些序列，如需将RFP序列插入A基因终止密码子后而sgRNA设计的位置在终止密码前10个氨基酸处，那设计donor时需要将这10个氨基酸对应的碱基序列加在左侧同源臂上。此外，donor质粒上sgRNA序列需要进行同义突变，防止重复编辑。
将需要敲入的基因序列（RFP序列等）放置于左右同源臂之间，一起合成克隆于pcDNA3.1载体上。
可选：制备ssDNA或dsDNA
ssDNA：
双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）都可以作为HDR修复机制的供体模板。不过，质粒或者PCR片段这样的dsDNA供体模板存在随机整合到基因组上的风险，在准确的基因编辑上的应用是非常有限的。而ssDNA随机整合的风险则大大降低，主要插入Cas9/sgRNA复合物所靶定的位点。与此同时，由于未整合的模板不能正常表达，这样可以更容易地识别并筛选出目的细胞克隆。此外，通过电穿孔方法导入时，ssDNA供体模板对细胞的毒性也要远低于dsDNA模板。
制备ssDNA的方法：Takara Guide-it™ Long ssDNA Production System v2
dsDNA：
制备dsDNA片段与上述同理，根据想要PCR的片段，订购5‘磷酸化的引物（方便细胞进行HDR修复）稀释至40μM，用上述试剂盒内的PrimeSTAR Max酶和推荐的程序对donor质粒进行PCR，每管100μL体系，共PCR 6管。
PCR产物纯化：用NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit进行产物纯化。每管100μL产物添加200μL NT1，然后分别过柱子，用NT3洗涤2遍。最后用20μL电转的GE buffer依次洗脱6个柱子的DNA，取1μL，稀释10倍后测浓度，同时跑胶观察位置。最终PCR产物的浓度在1-2μg/μL，可用于PCRNP电转。
具体参考Rapid generation of homozygous fluorescent knock-in human cells using CRISPR–Cas9 genome editing and validation by automated imaging and digital PCR screening
3. 增强HDR修复的若干手段
1、添加细胞周期阻滞剂（可能导致细胞死亡）
由于HDR主要发生在细胞周期的S期和G2期，可将细胞周期同步到HDR发生阶段来提高同源重组修复效率。
实验前12-16h，向培养物中添加细胞周期阻滞剂诺考达唑（Nocodazole），最终浓度为0.3 μmol/L。置于37℃，5% CO2条件下培养12-16 h。但需注意诺考达唑可能导致细胞死亡。
2、NHEJ抑制剂：
SCR7：
SNCR7是一种特异性 DNA Ligase IV 抑制剂，其阻断非同源性末端连接(NHEJ)；
在转染后的培养基中加入SCR7（10mM贮存液，1：10000稀释），使其浓度为1μM。后续继续保持1μM浓度直至分析。
Nedisertib/M3814：
DNA-PKcs 活性位点的小分子抑制剂
使用浓度：文献中使用1、2、2.5μM等浓度梯度，电转半小时后添加
4、将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转目的细胞
lipo2000转染质粒（6孔板）：
取EP管，加入适量（150μl/孔） Opti-MEM，加入适量（5-10μl/孔）Lipo2000混匀，室温下静置5分钟。
DNA稀释液：根据DNA的种类不同，分别于EP管中加入150μl/孔Opti-MEM，再加入2μg/孔质粒（knock-in：donor质粒 1ug/孔，PX459 Cas9-sgRNA质粒 1ug/孔）DNA轻轻混匀。
将Lipo2000稀释液加入到各DNA稀释液中，轻柔混匀，室温静置30min，形成DNA-Lipo2000复合物。
将制备好的DNA-Lipo2000复合物分别加入细胞培养基中，将培养板轻轻摇动使复合物分布均匀。并在4-6h后更换完全培养基。放入37℃ 5% CO2培养箱培养24-48h。
电转染（效率更高，毒性更小）：
参见下一章节（Cas9-RNP电转染）
5. 抗生素筛选，检测荧光
目的基因敲入需要根据gRNA质粒里面的荧光进行筛选或者进行抗生素抗性筛选，然后通过PCR等手段检测基因是否敲入（对照组细胞在抗生素筛选1-2周后应死亡或无荧光）。
6. PCR检测基因组
为了证实在基因组DNA中敲入基因（如GFP），设计靶向GFP上游的5’同源臂和靶向GFP下游的3’同源臂的一对引物。对照PCR产物大小即可知敲入是否成功。也可以设计引物1靶向GFP上游的5'同源臂和靶向插入基因内的引物2。
7. 单克隆分选
前期工作：准备2个96孔平底板，在96孔板的四周加上100ul的PBS（含双抗），中间6×10的孔中。
稀释细胞：将细胞倍比稀释至100个/mL，取1.5mL稀释液至加样槽，加入13.5mL培养基，用排枪每孔加入加入100ul细胞悬液（平均1-2个细胞/孔）。最后用无菌的parafilm封好四周。将细胞放回培养箱中培养，等待细胞分裂增殖到超过50%汇合度（一般会需要2周时间）。
单克隆消化传代：在显微镜下确认单克隆孔，吸去培养基，加入~50μL每孔胰酶消化，再加入200μL培养基终止，平均传到两块96孔板中（150 μl每孔），一块用于传代，一块用于PCR鉴定。
单克隆鉴定：通过设计引物，利用单克隆检验试剂盒（源井生物）进行PCR，检测基因是否敲除。为进一步验证，将PCR产物送去Sanger测序。
将敲入正确的多个单克隆进行扩增并冻存。需要注意的是尽可能多留几株不同的单克隆，以免某些单克隆的细胞特征与WT细胞差异过大。
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