🧪qPCR
By Kaiyi
基本原理
实验试剂
实验步骤
RNA提取
【Trizol提取】
新鲜细胞：使用至少 10^6 个细胞，用预冷的 PBS (1–2 mL) 洗涤一次。吸出 PBS（尽量吸尽），取出 4 度冰箱中预冷的 TRIzol，每管加入 1ml，反复吹打使细胞充分裂解。轻轻刮擦培养板，然后用移液器移除 TRIzol，将 TRIzol/细胞裂解物转移到 1.5 mL Ep管中。将样品在室温下放置 5 分钟。（一般6孔板用1mL的TRIzol，12/24孔板用500μL的TRIzol）；
冰冻细胞：将冻在-80℃的细胞/Trizol混合液在4℃化开；
细胞解冻后室温放置5min，与此同时将离心机4℃预冷；
取泡沫箱冰盒，在冰盒内铺置少量碎冰。
带上推车（冰盒、酒精湿巾、擦手纸、黄色垃圾袋、废液桶、EP管、200/1000μL枪头、记号笔、危化品柜钥匙）去通风橱：在每管EP管中加入Trizol五分之一体积的氯仿/三氯甲烷（如1000μL细胞加200μL氯仿，500μL细胞则加100μL氯仿），将管盖盖紧。
将样品带回实验室：颠倒混匀，涡旋振荡20秒后，室温静置 5 分钟。【加氯仿后可见液体分层，无色层在下，涡旋后则呈乳状，室温放置后无色层在上，含RNA】
调节离心机以 12000 rpm4℃ 离心 15 分钟。另取新的EP管进行标记。【离心后可见管中液体分三层：上层为包含 RNA 的透明水相，中层为白色 DNA 沉淀，下层为粉色的有机相】
带上冰盒、危化品钥匙、DPEC水去通风橱：使用 200μl量程的移液器分两次吸取共 200-250μl 的透明水相至新 EP 管中。此时尤其注意控制移液器吸液速度，不要吸到中层 DNA 沉淀，不要吸到侧面。
向新EP管水相中加入等体积【 250μl-400μL 】异丙醇，最上面会形成膜；将管内液体轻轻颠倒混匀30次。看到分层消失。4℃放置 10 分钟。
在通风橱内使用焦碳酸二乙酯水溶液（Diethyl pyrocarbonate，DEPC）与无水乙醇配置75%乙醇（有多少管细胞配多少毫升，适量多配），颠倒混匀。
将样品以及75%乙醇带回实验室：将75%置于4℃冰箱预冷；调节离心机为 4 度，并以 12000 rpm 离心 15 分钟【注意EP管耳朵突出处朝外】，可见管底白色 RNA 沉淀。弃去上清，将样品倒扣于擦手纸上。将EP管放在冰上。
吸干残留液体后，每管加入提前预冷的75%乙醇1mL【因二者混合后体积会比原总体积略减少，此时可以适量多配】，颠倒混匀。【此步为了洗去异丙醇，沉淀即为RNA】
4℃，10000rpm 离心5分钟。
弃去上清，将样品用力倒扣于擦手纸上。晾10min，待多数酒精挥发（可用20μL枪头轻轻移去管壁上的液滴），向 RNA沉淀中加入DEPC 水 20μl，轻轻吹打混匀。【此步骤非常关键：沉淀物过于干燥会导致 RNA 结晶且难以重新溶解；乙醇蒸发不充分也会阻碍 RNA 溶解。倒掉大部分乙醇洗涤液之后，Ep管底将剩下约 30–40 μL 乙醇。为了加速蒸发，可将管瞬时离心，迫使管壁上的残余液体转移到管底，然后尽量吸除乙醇。当沉淀周围只剩一小块半月形的溶液时，是向 RNA 沉淀中加入 DEPC 水的最佳时机】
使用 DanoDrop，取1μL样本在 260nm 波长下测量获取的 RNA 浓度。此时应注意 OD 260/280 值以 1.7-2.0 为佳。<1.7 表明有蛋白或酚类污染【确保不要吸入中间层和有机相】；>2.0 代表可能有异硫氰酸残留。
将样本置于-20℃保存。
【试剂盒提取】
RNA逆转录
在将RNA样本取出前，首先取若干干净的PCR管，在盖与管身上进行标记；
取冰盒或者碎冰，在冰上配置反应液：500ng的RNA+5X Mix 2μL，用水补齐至10μL
将EP管瞬离，使管壁上的液滴降至底部
逆转录：按推荐程序进行反应，其中第一步37℃可适当延长至45分钟
RT-qPCR
稀释逆转录反应液：在逆转录得到的10μL体系中加入90μL的水，将cDNA溶液稀释10倍。
RT-qPCR：
取96孔板，进行标记
在冰上进行加样，反应体系如下表：一般一个样本2-3个复孔，内参引物（如ACTB）+目的基因引物+Mix可以多配几个孔，每20μL体系加2μL的cDNA
加样完成后，瞬离，低速涡旋振荡【彻底混匀，减少气泡】
贴封口膜，用刮板封膜
RT-qPCR数据分析：
在Results表中，删除多余列，剩下Well Position、Sample Name，Target Name，CT
将复孔的CT值粘贴到右侧，右侧新建一列Average，计算CT平均值【可将CT值偏移较大的数值剔除】
用目的基因减去内参基因的平均CT值，得到ΔCT
计算对照组ΔCT的平均值
用每个ΔCT值减去刚刚计算好的对照组Average ΔCT
计算ΔΔCT：用每个ΔCT值减去刚刚计算好的对照组Average ΔCT值
计算2^(-ΔΔCT)：标化实验结果，最后数值导入Prism进行统计学分析
Ct值是什么？
qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时，所对应的循环数。
为什么要有Ct值？
模板量与Ct值的关系：在PCR指数扩增过程当中，产物量与循环数之间的关系是：扩增产物量=起始模板量×（1+En）循环个数。
Ct值的设定：qPCR扩增产物量是以荧光信号的形式直接呈现，也就是扩增曲线。在扩增过程当中，设定一个荧光信号值，当扩增产物量达到“一定产物量”时（即达到此荧光阈值时），此时循环数定义为Ct值，需要注意的是，Ct值需要处于指数扩增时期。因此Ct值与起始模板量的关系：模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。
Ct值的重现性：Ct值是荧光定量PCR最重要的结果呈现形式，用于基因表达量差异或基因拷贝数的结果计算。一般情况下，复孔Ct值的差值最好不超过0.05，不然表明误差结果太大，结果不可信。在PCR早期，扩增处于理想情况下，循环数较少，产物积累少，产生荧光的水平不能与荧光本底背景明显的区别；之后荧光的产生增加进入指数期，此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
Ct值的范围与影响因素？
扩增效率En：PCR扩增效率是指聚合酶把待扩增基因转变生成扩增子的效率。由1个DNA分子转变生成2个DNA分子时的扩增效率为100%。扩增效率常用En表示。En是一个非常重要的参数，Ct值可不可信，需要评估En是否正常，En的正常范围为90%-110%之间，影响En的因素有很多，常见的因素如下表：
影响因素
解释
如何判定？
PCR抑制剂
模板RNA中可能含有抑制PCR反应的物质，如蛋白质或去污剂等。反转录后的cDNA中含有高浓度的模板RNA和反转录试剂成分，也可能对后续PCR存在抑制。
1.可通过测定A260/A280和A260/A230比值或RNA电泳，判断是否存在污染。2.反转录后cDNA按照一定比例进行稀释。
引物设计不合理
引物不能有效退火
检查引物是否存在二聚体或发夹结构、存在错配；有时需注意跨内含子设计。
反应程序不合适
1.引物不能有效退火。2.DNA聚合酶活性未充分释放，3.长期高温，DNA聚合酶活性下降。
1.退火温度高于引物Tm值。2.预变性时间太短。3.反应程序各阶段时间过长。
试剂未充分混匀或移液误差
反应体系中，PCR反应成分的局部浓度过高或不均匀，导致PCR扩增不呈指数扩增。
扩增子长度
扩增子长度太长，超过300bp，扩增效率低。
检查扩增子长度是否在80bp-300bp之间。
qPCR试剂的影响
试剂中DNA聚合酶浓度较低或Buffer中离子浓度非最优化，导致Taq酶活力未达最强。
标准曲线测定引物扩增效率。
RNA二级结构
RNA的完整性与二级结构会影响扩增效率
RNA电泳
Ct值的范围：Ct值的范围为15-35。但是一般建议对于不同的基因Ct范围，因起始模板量中基因拷贝数和扩增效率不同，需做出该基因的标准曲线，计算出基因的线性检测范围以及En。
Ct值异常的原因与解决方案
问题
可能的原因
解决方法
Ct值过大
1.模板浓度低或存在PCR抑制物2.扩增效率低
1.提高模板浓度；或提高RNA或cDNA稀释比例；或重新制备模板。2.降低退火温度，或选用二步法扩增；组分和体系充分混匀；优化反应程序；或尝试更换试剂。
Ct值过小
1.模板浓度高2.NTC和NRC存在污染3.引物设计不合适
1.减少模板RNA量；或更高比例稀释cDNA。2.重新更换所有试剂；或使用UDGase防污染试剂。3.优化程序，避免非特性扩增。
附：
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