mRNA/Cas9-RNP电转

By Yiyuan & Kaiyi

mRNA电转实验步骤（T细胞）

1、复苏T细胞4h以上，将T细胞培养体系转移至50mL离心管【过滤以除去死细胞】，用opti-MEM补足50mL【此步用来洗清血清，避免影响电转效率】；
2、离心之前计数：台盼蓝：T细胞=1:1（10ul）；
3、500G 离心5min，弃去上清，弹匀；离心期间在6或12孔板（每孔最多5ml）加X-VIVO培养基，放入培养箱37℃预热。同时取出-80℃冻存的mRNA（1000ng/μL，每支10μL，可以电10*10^6细胞），待其融化至室温；
4、加1mL opti-MEM，转移至1.5ml EP管，4000rpm 2min离心，弃去上清，弹匀；
5、按上述步骤重复清洗一次；随后用800ul 1×opti-MEM重悬细胞。（认为耗损率为80%）
6、取一包RNAase free黄枪头，吹匀细胞悬液，再加入mRNA溶液混匀，在电转杯中加入100μL上述细胞液并吹匀【注意避免气泡】
7、盖上电转杯杯盖，500V 700μs电转，随后立即将其转移至12孔板中【倾斜电转杯以便吸液】，继续培养【注意用封口带封口，轻晃一下板子，37℃】，8-12h培养后测表达。

细胞量：min 10million（10×106），mRNA量：10ug（使用分装好的mRNA，1ug/ul per tube 20ul）。

电转条件：电转杯为0.2cm

（1）刺激过的T细胞（细胞变大，通透性高）：500V 700μs

（2）未刺激T细胞（antiCD3&CD28）：500V 800μs

Cas9-RNP电转原理

RNP指的是“核糖核酸-蛋白质复合物”，它由RNA和蛋白质组成。在RNP体外切割技术中，我们主要关注的是RNA引导的核酸内切酶（RGN）和CRISPR/Cas9系统中的Cas9蛋白。这两种物质协同作用，能够精确地对目标DNA进行切割。
原理：首先，设计一段与目标DNA序列互补的RNA（称为gRNA），将其与Cas9蛋白结合形成RNP。当RNP与目标DNA结合后，Cas9蛋白会在gRNA的引导下，对目标DNA进行精确切割。这样一来，我们就可以实现对特定基因的编辑、插入或删除等操作。

电转使用仪器为Neon NxT 转染仪，操作演示视频如下：

Cas9-RNP复合物电转

Cas9蛋白分装与储存：苏州泓迅生物提供，浓度为10mg/mL，按10μL分装后，保存于-80℃，避免反复冻融。
EasyEdit sgRNA 溶解与储存：将粉末状 EasyEdit sgRNA （苏州泓迅生物，RNA的3 'and 5'经过2'-0Me 与Phosphorothioate修饰, HPLC Purification）用无核酸酶 TE buffer 溶解至 100 pmol/μL (2nmol + 20μL TE buffer溶解)，或其他需要的浓度，按需分装，保存至-20℃，避免反复冻融，如需长期存储，保存至-80℃。

RNA化学合成：需要将设计的sgRNA序列的T改成U，在sgRNA的5’和3’端各加3个硫代和甲氧基修饰，可以提高sgRNA稳定性，并降低脱靶效应，并添加scaffold序列

转染前：将细胞提前铺板，直至长满T25；
正确组装好Neon NxT 电转仪电路，直至右侧出现黑色圆圈；
配置含有10%FBS但不含双抗的培养基；
取状态良好的对数期生长的靶细胞（约一个T25），弃培养基，用不含钙镁的DPBS冲洗一遍，加入1mL胰酶消化，400g离心5min（悬浮细胞可直接收集）；
离心期间，准备CRISPR-Cas9 RNP复合物：将 100 pmol Cas9 蛋白（1.63μL*10mg/mL）、200 pmol EasyEdit sgRNA（2μL* 100 pmol/μL）、65 μL Neon NxT Resuspension GE buffer（Thermo）加入 1.5 mL 规格的 EP 离心管中，在室温下孵育 10 min；
对于knock-in，可以从上述65μL体系中吸取6.5μL至另一EP管，在Cas9-RNP基础上再加入≤1μg的HDR模板（ssDNA或dsDNA，ssDNA可以提前浓缩至1μg/μL），室温孵育10min；后续再加入6.5μL的细胞悬液，孵育后用于电转；
对照设置：
- knock-out对照：cas9蛋白+相应的sgSCR或只加cas9蛋白；
- knock-in对照：cas9-RNP复合物，但不含HDR模板

Cas9与sgRNA比例约为1比2；
推荐的Cas9蛋白浓度：100pmol Cas9蛋白溶于130μL（65μLRNP+65μL细胞）体系，浓度约为120ug/1mL，即为推荐浓度；
推荐的细胞浓度：推荐每10μL电转体系约包含1*10^5个细胞（细胞浓度推荐在2*10^6-1*10^7个/mL之间），130μL体系需要1.3*10^6个细胞；
推荐的HDR DNA模板浓度：每10μL电转体系小于1μg的DNA；

弃去细胞沉淀上清，用不含钙镁的DPBS重悬后计数；
从细胞悬液中吸取1.5×10^6左右个细胞于无菌的1.5 mL EP管中，400g离心5min，弃上清，用 65 μL GE buffer 重悬细胞；
将细胞悬液与Cas9 RNP复合物悬液混匀，室温下孵育10min；
将2 mL E10 buffer（适用于10μL电转体系；E100 buffer则适用于100μL体系）加入到透明的buffer tube，并插入到底座上；
用电转枪吸上10 μL电转枪头，按下白色plugger，确保金属吸头可以回弹；
电转枪小心缓慢吹匀并吸取细胞与Cas9 RNP混合物（避免气泡！！！），将带有细胞悬液的电转枪插入电击杯中，如安装对位将亮蓝灯；
设置包括电压（V）、时间（s）、脉冲次数在内的电转参数（推荐2300/3/4，2500/2/5，1600/10/3，1700/20/1，1400/20/2），选择正确的Buffer种类（GE buffer），对上述混合物进行电转（可以同时在同样参数下电转EGFP对照组），电转成功后亮绿灯；
从底座中拔出电转枪，将电转后的各组细胞分别转移至12或24孔板中（培养基加血清但不加抗生素），先按蓝色ejector再按白色plugger，弃去电转枪吸头；
轻轻吹匀细胞，将细胞放置培养箱中培养；电转 1 h 后，细胞一般可以恢复活性，膜修复会完成。但因为质粒有毒性，膜修复完成后细胞也可能会因为毒性而死去；
24h后观察细胞状态，可根据EGFP对照情况判断电转效率；
WB检测敲除效率，进而分选单克隆。

HCT116 knock-in 电转参考文献：https://link.springer.com/article/10.1186/s12864-023-09377-3#Sec10

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mRNA电转实验步骤（T细胞）

1、复苏T细胞4h以上，将T细胞培养体系转移至50mL离心管【过滤以除去死细胞】，用opti-MEM补足50mL【此步用来洗清血清，避免影响电转效率】；

2、离心之前计数：台盼蓝：T细胞=1:1（10ul）；

3、500G 离心5min，弃去上清，弹匀；离心期间在6或12孔板（每孔最多5ml）加X-VIVO培养基，放入培养箱37℃预热。同时取出-80℃冻存的mRNA（1000ng/μL，每支10μL，可以电10*10^6细胞），待其融化至室温；

4、加1mL opti-MEM，转移至1.5ml EP管，4000rpm 2min离心，弃去上清，弹匀；

5、按上述步骤重复清洗一次；随后用800ul 1×opti-MEM重悬细胞。（认为耗损率为80%）

6、取一包RNAase free黄枪头，吹匀细胞悬液，再加入mRNA溶液混匀，在电转杯中加入100μL上述细胞液并吹匀【注意避免气泡】

7、盖上电转杯杯盖，500V 700μs电转，随后立即将其转移至12孔板中【倾斜电转杯以便吸液】，继续培养【注意用封口带封口，轻晃一下板子，37℃】，8-12h培养后测表达。

细胞量：min 10million（10×106），mRNA量：10ug（使用分装好的mRNA，1ug/ul per tube 20ul）。

电转条件：电转杯为0.2cm

（1）刺激过的T细胞（细胞变大，通透性高）：500V 700μs

（2）未刺激T细胞（antiCD3&CD28）：500V 800μs

Cas9-RNP电转原理

RNP指的是“核糖核酸-蛋白质复合物”，它由RNA和蛋白质组成。在RNP体外切割技术中，我们主要关注的是RNA引导的核酸内切酶（RGN）和CRISPR/Cas9系统中的Cas9蛋白。这两种物质协同作用，能够精确地对目标DNA进行切割。

原理：首先，设计一段与目标DNA序列互补的RNA（称为gRNA），将其与Cas9蛋白结合形成RNP。当RNP与目标DNA结合后，Cas9蛋白会在gRNA的引导下，对目标DNA进行精确切割。这样一来，我们就可以实现对特定基因的编辑、插入或删除等操作。

电转使用仪器为Neon NxT 转染仪，操作演示视频如下：

演示视频

Cas9-RNP复合物电转

Cas9蛋白分装与储存：苏州泓迅生物提供，浓度为10mg/mL，按10μL分装后，保存于-80℃，避免反复冻融。

EasyEdit sgRNA 溶解与储存：将粉末状 EasyEdit sgRNA （苏州泓迅生物，RNA的3 'and 5'经过2'-0Me 与Phosphorothioate修饰, HPLC Purification）用无核酸酶 TE buffer 溶解至 100 pmol/μL (2nmol + 20μL TE buffer溶解)，或其他需要的浓度，按需分装，保存至-20℃，避免反复冻融，如需长期存储，保存至-80℃。

RNA化学合成：需要将设计的sgRNA序列的T改成U，在sgRNA的5’和3’端各加3个硫代和甲氧基修饰，可以提高sgRNA稳定性，并降低脱靶效应，并添加scaffold序列

转染前：将细胞提前铺板，直至长满T25；

正确组装好Neon NxT 电转仪电路，直至右侧出现黑色圆圈；

配置含有10%FBS但不含双抗的培养基；

取状态良好的对数期生长的靶细胞（约一个T25），弃培养基，用不含钙镁的DPBS冲洗一遍，加入1mL胰酶消化，400g离心5min（悬浮细胞可直接收集）；

离心期间，准备CRISPR-Cas9 RNP复合物：将 100 pmol Cas9 蛋白（1.63μL*10mg/mL）、200 pmol EasyEdit sgRNA（2μL* 100 pmol/μL）、65 μL Neon NxT Resuspension GE buffer（Thermo）加入 1.5 mL 规格的 EP 离心管中，在室温下孵育 10 min；

对于knock-in，可以从上述65μL体系中吸取6.5μL至另一EP管，在Cas9-RNP基础上再加入≤1μg的HDR模板（ssDNA或dsDNA，ssDNA可以提前浓缩至1μg/μL），室温孵育10min；后续再加入6.5μL的细胞悬液，孵育后用于电转；

对照设置：

knock-out对照：cas9蛋白+相应的sgSCR或只加cas9蛋白；
knock-in对照：cas9-RNP复合物，但不含HDR模板

Cas9与sgRNA比例约为1比2；

推荐的Cas9蛋白浓度：100pmol Cas9蛋白溶于130μL（65μLRNP+65μL细胞）体系，浓度约为120ug/1mL，即为推荐浓度；

推荐的细胞浓度：推荐每10μL电转体系约包含1*10^5个细胞（细胞浓度推荐在2*10^6-1*10^7个/mL之间），130μL体系需要1.3*10^6个细胞；

推荐的HDR DNA模板浓度：每10μL电转体系小于1μg的DNA；

弃去细胞沉淀上清，用不含钙镁的DPBS重悬后计数；

从细胞悬液中吸取1.5×10^6左右个细胞于无菌的1.5 mL EP管中，400g离心5min，弃上清，用 65 μL GE buffer 重悬细胞；

将细胞悬液与Cas9 RNP复合物悬液混匀，室温下孵育10min；

将2 mL E10 buffer（适用于10μL电转体系；E100 buffer则适用于100μL体系）加入到透明的buffer tube，并插入到底座上；

用电转枪吸上10 μL电转枪头，按下白色plugger，确保金属吸头可以回弹；

电转枪小心缓慢吹匀并吸取细胞与Cas9 RNP混合物（避免气泡！！！），将带有细胞悬液的电转枪插入电击杯中，如安装对位将亮蓝灯；

设置包括电压（V）、时间（s）、脉冲次数在内的电转参数（推荐2300/3/4，2500/2/5，1600/10/3，1700/20/1，1400/20/2），选择正确的Buffer种类（GE buffer），对上述混合物进行电转（可以同时在同样参数下电转EGFP对照组），电转成功后亮绿灯；

从底座中拔出电转枪，将电转后的各组细胞分别转移至12或24孔板中（培养基加血清但不加抗生素），先按蓝色ejector再按白色plugger，弃去电转枪吸头；

轻轻吹匀细胞，将细胞放置培养箱中培养；电转 1 h 后，细胞一般可以恢复活性，膜修复会完成。但因为质粒有毒性，膜修复完成后细胞也可能会因为毒性而死去；

24h后观察细胞状态，可根据EGFP对照情况判断电转效率；

WB检测敲除效率，进而分选单克隆。