🧫质粒/shRNA/RNP脂质体转染

By Kaiyi Fu

质粒瞬转肿瘤细胞实验步骤

1、转染前一天

• 铺板适量细胞，培养24h，直至70-90%融合；

• 首次实验可以每组准备2个复孔，用不同lipo3000浓度进行转染；

2、转染当天（6孔板为例）

• 预热培养基，将培养基更换为新鲜培养基；

• 每孔准备2个EP管：

  • 管1：125μL Opti-MEM + 2.5 μg 质粒DNA + 5μL P3000（2μL/μg DNA，如果是siRNA不用加），混匀；

  • 管2：125μL Opti-MEM + 3.75/7.5μL lipo3000，混匀；

• 向lipo3000所在EP管加入DNA，室温孵育15min；

• 将DNA-lipo复合物加入细胞，可不换液；

shRNA质粒瞬转实验步骤

1、转染前一天

• 接种2*10^5细胞/孔（MC38长得不快，可以加到5*10^5）于24孔板中，加入500μL含血清DMEM培养基，培养24h，至70-80%融合

• 其他孔板的细胞密度见下表

2、转染当天（以24孔板为例）

• 提前6-8h用Opti-MEM饥饿处理需要转染的细胞，以提升转染效率

• 配置质粒溶液：取若干EP管，每管加50μL Opti-MEM培养基与1μg DNA（公司给的是500ng/μL，加2μL即可，可适量增大剂量），混匀。【注意分组：需要有空白组，NC，GAPDH，HPD的不同分组】

• 配置转染试剂：取若干EP管，每管加入50μLOpti-MEM与2-5μL的Lipo2000，混匀，室温放置5min。

• 另取离心管，将转染试剂滴加至shRNA质粒溶液中。轻柔混匀，室温放置20min。

• 等待间隙，取10mL DMEM培养基37℃预热，在加转染试剂前吸掉原有培养基，用PBS洗一遍，加入400μL无血清DMEM培养基。

• 将混合液加至含细胞与培养基的孔中，来回轻柔摇晃，充分混合。

• 孵育4h，更换含血清培养基，去除复合物。

• 细胞继续培养24-48h。过程中注意换液。

• 所得细胞用于RNA抽提（24h）+RT-PCR以及Western Blot检测（48h）。

3、转染第二天

• 在显微镜下统计表达绿色荧光的细胞，计算转染效率。

• 收集细胞，进行qPCR以及WB，检测基因表达变化【24h检测RNA水平，48h后检测蛋白水平，中途只换液不传代】。

• 选择抑制率最高的shRNA进行下一批实验。

CRISPR RNP瞬转实验步骤

1. 在转染前 1 天，将细胞铺至 24 孔板中，1×10^5 个细胞/孔；

2. 准备 2 个 1.5 mL 规格的 EP 离心管，标记为 A 和 B；

3. A 管中加入：25 µL Opti-MEM TM (赛默飞)、36 pmol Cas9 蛋白（0.6μL*10mg/mL）、36 pmol EasyEdit sgRNA（0.4μL* 100 pmol/μL）， 室温孵育 15 min；

4. B 管中加入：25 µL Opti-MEMTM (赛默飞)、1.5 µL LipofectamineTM 2000 (赛默飞)；

5. 将 A 管和 B 管中的溶液轻柔的混合，并在室温下孵育 10 min；

6. 将混合后的溶液加入 24 孔板中，50 µL/孔，将细胞置于 37℃培养箱中孵育；

7. 72 h 后收集细胞，用于测序、INDEL 检测等后续操作。